茯苓β-tubulin 基因实时荧光定量PCR 体系的建立和评估

旨在以不同生长时期茯苓为材料，β-tubulin基因为内参基因，建立实时荧光定量PCR体系。根据GenBank上同为真菌的黄曲霉菌β-tubulin基因保守区域设计内参引物，以茯苓菌丝体、初期菌核和成熟期菌核cDNA为模版，检测内参引物的特异性和稳定性；并对PCR反应体系中的引物浓度和模板浓度进行优化；最后利用茯苓转录组数据中6个显著差异表达基因对优化后的反应体系进行表达分析与验证。结果显示，综合扩增曲线和溶解曲线分析，在茯苓不同生长发育时期，β-tubulin基因表达水平基本恒定；对比内参引物在不同浓度条件下的扩增效率，得到模板和引物的最优浓度分别为80 ng／μL和1μmol／L。在优化后的反应体系中，6个差异表达基因的表达变化趋势与转录组测序结果基本一致，得到的线性相关系数r值均大于0．9，呈显著性正相关。成功地建立了以β-tubulin基因为内参基因的茯苓实时荧光定量PCR体系。