启动子串联及改造提高FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶在Bacillus subtilis中的表达

以黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)为辅基的葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase with FAD,FAD-GDH,EC 1.1.99.10),与辅基结合紧密,催化效率高,是临床检测血糖指标的新型诊断用酶.将Burkholderia cepacia的FAD-GDH基因(gdh)构建含单启动PHpaⅡ的穿梭质粒pMA5-1,在蛋白酶缺陷型菌株Bacillus subtilis WB600中表达.为了获得该酶的高效表达,采用启动子串联及改造策略考察产酶情况.将4种启动子(PamyQ·,P43,PgsiB,Popuaa)分别与质粒上自带的启动子PHpaⅡ串联,结果表明PHpaⅡ-PamyQ·串联组合获得的FAD-GDH胞内酶活最高,为2 497 U/L,是串联前单启动子的2.7倍.为了减少发酵过程中,葡萄糖和甘油对产酶的抑制作用,在串联组合的基础上删去PamyQ·启动子中与碳代谢调控蛋白结合的cre位点,使胞内产酶水平提高至3 626 U/L,说明cre位点的去除能够减少碳代谢产物对启动子转录的抑制.本研究为新型诊断用酶FAD-GDH的菌种改造和工业化生产应用提供参考与借鉴.