水产品中副溶血性弧菌PMA-ddPCR活菌定量检测方法的研究

本研究旨在针对水产品中活的副溶血性弧菌建立一种快速定量的PCR检测方法.基于叠氮溴化丙锭(PMA)在一定光照条件下能抑制死亡菌DNA扩增,以及微滴式数字PCR技术能将检测精度扩展至单分子目标基因,并实现绝对定量的特点,以副溶血性弧菌tlh基因为目的片段设计及筛选适合的特异性引物与探针,优化反应体系,通过对PMA浓度及曝光条件等优化,建立了一种联用PMA-ddPCR技术快速检测水产品中活的副溶血性弧菌的定量检测方法.研究结果显示:选择16 μg/mL作为PMA工作浓度,曝光时间为8 min,此条件下能够完全抑制副溶血性弧菌死菌的DNA扩增并对活菌扩增无影响.通过对比PMA-ddPCR和PMA-qPCR的检测低限分别为2×101 cfu/mL、2×102 cfu/mL,PMA-ddPCR法的灵敏度比PMA-qPCR法的高.应用PMA-ddPCR定量方法检测人工污染的基围虾和小帆立贝这两种海产品,在基围虾中最低可检出1.9×101 cfu/g的副溶血性弧菌、在小帆立贝中最低可检出8.9 cfu/g的副溶血性弧菌.该研究为将PCR技术实际应用于水产品中低量污染、活的副溶血性弧菌的定量检测奠定了基础.