水产品中副溶血性弧菌LAMP检测方法的优化

本文用副溶血性弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作靶标,优化环介导等温扩增技术检测水产品副溶血性弧菌的方法.体系用BstDNA聚合酶催化,恒温反应60 min,产物分别用2％琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green Ⅰ染色鉴定,对各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP和PCR反应,比较二者的敏感度;对32株食源性病原菌(包括分离于水产品的25株副溶血弧菌,1株副溶血性弧菌ATCC 17802标准株,大肠杆菌D5、金黄色葡萄球菌CMCC26003、志贺氏菌B34、蜡样芽胞杆菌63302、单核细胞增生李斯特菌54001和沙门氏菌50041各1株)进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP 的可靠性.各参数最佳条件为:Mg2+浓度为3.6 mmol/L,dNTPs浓度为0.96 mmol/L,Bst DNA聚合酶用量为4.8 U,内外引物浓度比为8∶1,最佳反应温度为63℃,时间为60 min;LAMP的检测限为1 CFU/mL,低于PCR方法的最低检测限;特异性谈佥检测26株副溶血性弧菌均为阳性,6株非副溶血性弧菌为阴性;人工污染试验中检测限达1 CFU/mL,无假阳性.建立的LAMP方法操作简单且灵敏度高,适用于水产食品中副溶血弧菌的现场快速检测.