构建M23-AQP4稳定表达的HEK293细胞应用于血清抗AQP4抗体检测的研究

目的 构建M23-AQP4稳定表达HEK293细胞(HEK293-M23-AQP4)并用于抗AQP4抗体检测,以探索临床可行的抗AQP4抗体检测方法.方法 用磷酸钙转染试剂将pEGFP-N1-M23-AQP4质粒转入HEK293细胞,通过G418筛选HEK293-M23-AQP4,以细胞间接免疫荧光法(CBA)检测M23-AQP4表达及分布.以HEK293-M23-AQP4为底物的CBA法检测视神经脊髓炎(NMO)6例、多发性硬化(MS) 16例、其他脱髓鞘疾病(视神经炎、脊髓炎、吉兰-巴雷综合征、急性播散性脑脊髓炎)30例、非脱髓鞘性疾病患者10例血清抗AQP4抗体及其滴度,并比较4组抗体阳性率,计算抗AQP4抗体诊断NMO的敏感性,分别以非NMO的脱髓鞘疾病和非脱髓鞘疾病作对照计算抗AQP4抗体诊断NMO的特异性.将HEK293-M23-AQP4细胞于室温、4℃、-20℃保存4周,分别作为底物检测经首次检测所得抗AQP4抗体阳性标本并随机选取5例抗体阴性标本的抗AQP4抗体及滴度,比较其阳性率及滴度变化;将上述首次检测所得抗AQP4抗体阳性标本及5例抗体阴性标本反复冻融3次后分别于室温、4℃、-20℃保存1周后,检测其抗AQP4抗体及滴度,比较阳性率和滴度变化.结果 HEK293-M23-AQP4构建成功,M23-AQP4主要表达在细胞膜上.NMO患者抗AQP4抗体阳性率达83.3％ (5/6),显著高于MS患者[6.3％(1/16)]、其他脱髓鞘疾病[3.3％(1/30)]和非脱髓鞘性疾病[0.0％(0/10)](均P＜0.01);抗AQP4抗体诊断NMO的敏感性为83.3％(5/6),以非NMO的脱髓鞘疾病作对照时,其诊断NMO特异性为95.6％(44/46),以非脱髓鞘疾病作对照时,其诊断NMO特异性为100％(10/10).HEK293-M23-AQP4于不同温度保存后所检测抗AQP4抗体阳性率和滴度与首次检测比较均无统计学意义(均P=1.0).血清标本4℃及-20℃保存1周后所检测抗AQP4抗体阳性率和滴度与首次检测比较差异均无统计学意义(均P=1.0);室温保存1周后抗体滴度(1∶400、1∶400、1∶3200、1∶6400、1∶6400、1∶12800、1 ∶51200)与首次检测(1∶800、1∶1600、1∶12800、1∶25600、1∶25600、1∶51200、1∶120400)比较均显著下降(均P＜0.01),但阳性率差异无统计学意义(P=1.0).结论 成功构建HEK293-M23-AQP4细胞.以此细胞为底物的CBA法检测血清抗AQP4抗体对诊断NMO的敏感性和特异性较高,且对标本存储条件要求较低.