miR21对心脏微血管内皮细胞PDCD4/AP1通路的调节作用

目的 探讨柯萨奇B3病毒(CVB3)感染离体培养的大鼠心脏微血管内皮细胞(CMVECs)后,miR-21对PDCD4和转录因子AP1构成的调节通路的影响.方法 (1)CVB3感染CMVECs 48h,实时荧光定量PCR检测各组细胞中miR-21表达;(2) CVB3病毒感染CMVECs48h后,Western Blot法检测各组细胞中PDCD4蛋白表达;(3) CMVECs瞬时转染miR-21模拟物48h后,WesternBlot法检测各组细胞中PDCD4蛋白表达;(4)双荧光素酶报告基因法研究miR-21与PDCD4基因靶向结合位点;(5) CMVECs细胞共转染PDCD4和AP1-Luc质粒,检测AP1-Luc荧光素酶活性以观察PDCD4基因对AP1活性的影响;(6)提取各组细胞核蛋白,电泳迁移率改变实验(EMSA实验)检测AP1和DNA的结合活性.结果 (1) CMVECs感染CVB3病毒48小时后,与对照组比较,病毒感染组miR-21表达上调4.12倍;(2)CMVECs感染CVB3病毒48小时后,与对照组比较,病毒感染组PDCD4蛋白表达明显下调;(3)CMVECs过表达miR-21后PDCD4蛋白表达下调;(4) CMVECs过表达miR-21后显著抑制野生型PDCD4基因3'UTR活性,而对突变型3' UTR活性无影响;(5) CMVECs过表达PDCD4基因48h后AP1-Luc荧光素酶活性与对照组相比明显下调;CMVECs过表达miR-21 48h后AP1-Luc荧光素酶活性与对照组相比显著上调;(6) EMSA实验结果显示CMVECs过表达PDCD4 48h后AP1与DNA结合活性明显下调,过表达miR-21后AP1与DNA结合活性明显上调.结论 CVB3感染CMVECs后上调miRNA-21表达.miR-21通过与靶基因PDCD4的3'非翻译区(3' UTR)靶向结合抑制PDCD4表达、上调AP1活性及AP1与DNA结合活性.