鉴别猪瘟野毒与疫苗毒的单一与二重 RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种对猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)临床样本快速、简便的检测技术,以区分猪瘟(classical swine fever,CSF)野毒和疫苗毒感染,为规模化猪场 CSF 净化奠定基础。通过对 GenBank 中 CSF 野毒、疫苗毒及近源病毒的基因组全序列比对,发现 CSF 兔化弱毒疫苗株3′-NTR 独立存在富含 T 的插入序列,根据这一特点分别在该插入序列的上、下两端设计2对单一 RT-PCR 引物并选择特异保守区域设计了二重 RT-PCR 引物,优化筛选能够鉴别 CSF 野毒与兔化弱毒疫苗的 PCR 反应条件,建立了能鉴别 CSF 野毒和疫苗毒的单一与二重 RT-PCR 鉴别诊断方法。敏感性和特异性分析表明,单一 RT-PCR 检测 CSFV 各引物最低核酸检测量分别为2.2 pg(单一 RT-PCR 中的1对引物)和1.7 pg(单一 RT-PCR 中的另外1对引物)；二重 RT-PCR 检测 CSFV 各引物最低核酸检测量分别为8.2 pg(CSF 野毒)和6.7 pg(CSF 疫苗毒),两种方法均检测不到 PRV、PRRSV、JEV、BVDV、PCV2的 DNA/RNA。采用该方法对146份可疑临床样品进行检测,结果表明 CSF 疫苗毒与野毒在能繁母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的二重感染率分别为6.3%、7.4%、8.3%、8.6%。本研究建立的单一与二重RT-PCR 方法都具有敏感性强、特异性优、重复性好的特点,该研究对规模化猪场猪瘟的净化具有十分重要的参考价值。