水牛 MBD3基因克隆分析及其真核表达载体的构建

本研究旨在克隆水牛 MBD3基因，进行生物信息学分析，并构建 MBD3基因的真核表达载体，为研究MBD3基因在水牛胚胎发育及诱导多能干细胞（iPSCs）中的作用奠定基础。试验从卵巢组织中提取总RNA ，反转录得到cDNA ，并以此为模板，应用 RT‐PCR克隆得到 MBD3基因，测序并应用相关的生物学软件进行分析；将MBD3基因连接至真核表达载体pEGFP‐C1，再将携带目的基因的重组质粒转染 HEK293T 细胞和水牛胎儿成纤维细胞（BFF），利用RT‐PCR及Western blotting方法分析目的基因的表达。结果表明，克隆获得了898 bp的水牛MBD3基因序列，其中编码区全长774 bp ，编码257个氨基酸。通过对 MBD3基因核苷酸序列的多重比对及进化树分析，MBD3基因在进化中高度保守，特别是M BD结构域，水牛与牛的同源性为100％，与人、猪、猩猩的同源性均为97％。将水牛 MBD3基因真核表达载体转染 HEK293T 细胞和BFF ，通过荧光观察、RT‐PCR及Western blo t ting方法鉴定表明，成功构建了水牛 MBD3基因的真核表达载体。本研究克隆得到了水牛的 MBD3基因，并成功构建了 MBD3基因的真核表达载体，为进一步研究 MBD3基因在水牛胚胎发育及iPSCs诱导上的作用奠定了基础。