GRP78重组表达腺病毒的构建及在HepG2细胞的表达及其相关功能研究

目的:构建葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)重组表达腺病毒pAd-GRP78,并感染HepG2细胞建立能够高表达GRP78的细胞模型,同时在HepG2细胞中研究重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖能力的影响.方法:利用腺病毒穿梭质粒pAdTrack-rO4构建载有GRP78基因的穿梭质粒pAdTrack-TO4-GRP78载体,并通过基因测序鉴定载体序列正确.将载体用PmeⅠ酶切线性化,与AdEasy-BJ5183感受态细胞进行基因同源重组.将重组后的腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,转染到HEK293细胞中进行包裹,根据增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的表达判断重组腺病毒的包装情况.通过反复离心和低温裂解细胞提取GRP78重组表达腺病毒.以人肝癌HepG2细胞为目标,进行病毒感染.通过qRT-PCR检测GRP78基因表达情况,使用Western blot检测GRP78蛋白的表达.最后感染HepG2细胞,通过MTS比色法检测重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖的影响.结果:测序验证pAdTrack-TO4-GRP78构建成功,酶切验证重组腺病毒载体pAd-GRP78构建成功.在HEK293细胞中将pAd-GRP78包裹,GPF荧光检测结果表示病毒包装成功.使用pAd-GRP78感染人肝癌HepG2细胞,qRT-PCR检测到细胞中GRP78基因的过表达,Western blot方法检测到GRP78蛋白的高表达.MTS检测结果显示重组表达GRP78腺病毒对HepG2肝癌细胞有促增殖作用.结论:实验成功构建了GRP78重组表达腺病毒,并验证了构建的腺病毒载体可以收集并感染HepG2细胞表达GRP78蛋白.证明了重组表达GRP78腺病毒能够促进肝癌细胞的增殖.为进一步研究GRP78的功能奠定了基础.