含PTD结构域的MAGE－A3融合蛋白表达、纯化及生物学功能的初步研究

【目的】构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域TAT的黑色素瘤相关基因MAGE－A3融合蛋白TAT－MAGE－A3－EGFP，并观察其生物学功能，【方法】1）构建质粒pET28a－TAT－MAGE－A3－EGFP、对照组pET28a－MAGE－A3－EGFP和pET28a－TAT－EGFP原核表达载体，在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达，经SDS－PAGE电泳和Western Blot鉴定并通过Ni＋柱纯化获得TAT－MAGE－A3－EGFP、MAGE－A3－EGFP、TAT－EGFP三种融合蛋白；2）动态荧光显微镜观察MAGE－A3、TAT－MAGE－A3－EGFP、TAT－EGFP三种融合蛋白在细胞中的不同分布，流式细胞术观察三种融合蛋白穿膜效率的差异。【结果】1）成功构建了pET28a－TAT－MAGE－A3－EGFP、pET28a－MAGE－A3－EGFP和pET28a－TAT－EGFP原核表达载体，并获得了TAT－MAGE－A3－EGFP、MAGE－A3－EGFP和TAT－EGFP融合蛋白。2）动态荧光显微镜和流式细胞术显示TAT－MAGE －A3－EGFP与MAGE－A3－EGFP相比能更高效地穿过细胞膜进入细胞内，并定位于细胞质和细胞核，且与TAT－EGFP相比穿膜效率区别不大。【结论】TAT－MAGE－A3－EGFP融合蛋白可在原核表达系统中高效表达，并具有高效穿透细胞膜能力，且带有PTD结构的融合蛋白穿膜能力与分子量无直接关系。