人皮肤微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定

背景：目前，国内外研究多采用酶消化法结合免疫磁珠法分离微血管内皮细胞，然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而，如何简化人皮肤微血管内皮细胞分离、培养，同时又能获得到高纯度的内皮细胞体外培养方法成为研究热点。
　　目的：探索一种简便高效的来源于糖尿病患者皮肤微血管内皮细胞的体外培养方法，观察细胞生长状态并进行鉴定。
　　方法：利用临床上糖尿病伴足部慢性创面截肢后，肢体近心端皮肤和局部创面周围皮肤真皮浅层组织。经剪碎后采用贴壁法和短时少量应用胰酶法得到人皮肤微血管内皮细胞，传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。
　　结果与结论：①实验成功获取人皮肤微血管内皮细胞，原代培养的人皮肤微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁，第10天进入对数生长期，第12至13天细胞浓度达80%，传代细胞较原代细胞生长活跃，培养5-7d可长满培养瓶底，呈“铺路石样”排布；②免疫组织化学染色结果显示，培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原呈阳性，细胞阳性率达100%；③MTT 法测得培养第2、4、5代人皮肤微血管内皮细胞的生长曲线呈倒“S”形。④结果证实，应用贴壁法，并在培养过程中少量短时应用胰酶法，可获得大量高纯度的人皮肤微血管内皮细胞。