Hsd3β2基因RNA干扰载体构建及对鸡ESCs向PGCs分化的调控

原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)作为配子的原始祖细胞,参与胚胎生殖细胞的发育过程.类固醇激素通路中3β羟基类固醇脱氢酶2(3β-hydroxysteroid dehydrogenase 2,Hsd3β2)能促进细胞分化,但其对原始生殖细胞的形成具体调控机制还不得而知.本研究旨在通过构建类固醇激素合成过程中关键基因Hsd3β2的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰载体并研究其对鸡(Gallus gallus)胚胎干细胞分化为原始生殖细胞的影响.通过慢病毒包装Hsd3β2感染鸡胚胎干细胞并进行RNA干扰(RNAinterference,RNAi)诱导,分别于2、4、6d观察细胞形态变化并收集细胞样品,qRT-PCR检测Hsd3β2、生殖标记基因鸡Vasa基因同系物(chicken vasa homologue,Cvh)、鸡KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(chicken KIT proto-oncogene receptor tyrosine kinase,C-kit)及甾类激素合成信号通路下游基因细胞色素P450亚酶(cytochrome P450 subenzyme,Cyplal)、葡萄糖醛酸转移酶1A1 (UDP glucuronosyltransferase family 1 member A1,Ugt1a1)和17β羟基类固醇脱氢酶7(17beta-hydroxysteroid dehydrogenase7,Hsd17b7)表达;流式细胞检测诱导产生类胚体阳性率;在鸡胚孵化过程中鸡胚注射慢病毒干扰载体,孵化4.5 d后收集生殖嵴,qRT-PCR检测Cvh、C-kit及下游基因Cyp1a1、Ugt1a1和Hsd17b7表达;流式细胞分析原始生殖细胞生成效率.本实验成功构建sh-Hsd3β2慢病毒载体,挽救实验表明过表达Hsd3β2能使shRNA引起的基因表达下降回升;在体外诱导过程和鸡胚孵化过程中,qRT-PCR结果表明干扰Hsd3β2后,甾类激素合成信号通路中的下游基因的表达显著下调(P＜0.01);在RA诱导实验过程中,随诱导时间推进,类胚体数量逐渐增加.Hsd3β2抑制后,类胚体形成数量减少.Cvh、C-kit在诱导过程中上调表达,但Hsd3β2干扰后,其表达显著降低(P＜0.01),流式细胞分析表明干扰Hsd3β2后,诱导4d后产生类胚体阳性细胞(3.27±0.19)％显著低于对照组(7.39±0.09)％;体内实验结果表明干扰Hsd3β2后,Cvh、C-kit表达显著降低(P＜0.01),生殖细胞数量显著减少.本研究结果表明Hsd32能通过甾类激素合成信号通路促进原始生殖细胞的形成,为研究该通路对原始生殖细胞形成具体机制提供理论基础.