基于网络药理学预测荜茇抗肝纤维化作用及验证研究

基于网络药理学及肝纤维化(liver fibrosis,LF)体外模型方法探讨荜茇及其主要活性成分抗肝纤维化的作用机制.通过TCMSP及TCMIP数据库,结合口服生物利用度(oral bioavailability,OB)、类药性(drug-likeness,DL)、肠上皮通透性(Caco-2)和drug-likeness grading作为限定条件获取荜茇主要活性成分.利用TCMSP搜索荜茇相关靶基因,在GeneCards数据库搜索与LF相关的基因,采用Cytoscape 3.7.1软件,构建荜茇潜在活性化合物-抗肝纤维化靶点网络.使用STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用分析,构建蛋白质-蛋白质相互作用网络.使用Bioconductor数据库对荜茇抗LF作用靶点进行基因本体(GO)富集分析与KEGG通路分析.最后,通过荜茇活性成分荜茇酰胺(piperlongumine,PL)干预大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的体外实验进行核心靶点和通路的初步验证,考察荜茇酰胺抑制大鼠肝星状细胞增殖及对肝纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)的影响,检测肝纤维化过程肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),NF-κB p65及白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)蛋白表达.网络药理学发现,通过对生物利用度、类药性的分析得到荜茇酰胺等12种潜在活性化合物,涉及抗肝纤维化作用靶点48个.GO功能富集分析得到GO条目1 240个,大部分与生物过程和分子功能相关.KEGG通路富集筛选得到99条信号通路,包括TNF信号通路、cGMP-PKG信号通路、钙信号通路等.CCK-8检测表明,PL可抑制转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的HSC-T6增殖.Western blot分析表明,PL可下调HSC-T6中α-SMA和collagen Ⅰ表达,抑制TNF-α和p65蛋白表达.酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)结果表明,PL可降低HSC-T6培养上清中TNF-α及IL-6含量.结果 显示,PL可通过调控TNF/NF-κB信号通路而发挥治疗肝纤维化作用.该研究增加了中药荜茇及其有效成分抗LF药理作用的新认识,也为进一步深入探讨其具体的调控机制及关键的靶标奠定理论基础.