山羊Viperin基因的克隆与真核表达载体的构建

本研究分离山羊外周血单核细胞,设计引物,采用RT-PCR方法扩增出Viperin基因完整阅读框.经BLAST分析,该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank中已有序列的最高同源性均为99％.同时将不同物种(山羊、猪、人、小鼠)的氨基酸序列进行比对分析,发现N端结构域在不同物种间是高变区.然后,将目的基因酶切克隆入真核表达载体pcDNA3.1中构建重组表达质粒.经PCR、酶切和测序鉴定正确的阳性质粒分别被命名为pcDNA-gViHA和pcDNA-HAgVi.使用脂质体Lipofectamine 2 000将重组质粒转染BHK21细胞,使用HA抗体进行间接免疫荧光检测,发现重组蛋白均得到表达,荧光分布于细胞质中;Western-blot结果表明,两个质粒转染后均可检测到分子量约为43 ku的条带.使用内质网标志物Calnexin抗体进行共聚焦检测,发现表达的Viperin蛋白与内质网存在共定位.上述研究结果为进一步研究山羊Viperin的抗病毒作用及其机制奠定了基础.