慢病毒介导EGFP基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究

背景 研究发现人羊膜上皮细胞(AECs)具有干细胞的某些特性,已有学者用其进行眼表重建,其可能是角膜表层重建的一种新型种子细胞.目的 探讨经慢病毒载体(pLenti6/V5-DEST)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因修饰的人AECs作为组织工程化角膜表层一种新的细胞来源的应用价值.方法 利用慢病毒载体携带标记基因EGFP转染人AECs,荧光显微镜下观察转染基因的瞬时表达,倒置显微镜下观察转染细胞的生长形态,用流式细胞仪检测转染细胞中EGFP的阳性表达率,然后应用EGFP基因修饰的人AECs构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料.手术切除兔眼的全部角膜缘组织制备角膜缘干细胞缺损动物模型,随机分为2组,实验组兔眼移植EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞-角膜基质移植材料,对照组兔眼移植无上皮细胞的角膜基质移植材料,每天裂隙灯下观察2组兔眼角膜的混浊、结膜上皮化和新生血管化情况.1个月后处死动物摘除眼球,荧光显微镜下观察角膜植片中EGFP的表达,用免疫组织化学法检测其细胞角蛋白8(CK8)、CK18和CK12的表达,以鉴定移植细胞分化为角膜样的上皮细胞.结果 大多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞与正常体外培养的人AECs形态相似,流式细胞仪检测显示瞬时转染48 h的人AECs中EGFP阳性表达率最高,为61.50%,与12、24、96 h转染组15.24%、38.27%、39.10%比较差异均有统计学意义(P＜0.05),与72 h转染组的58.36%比较差异无统计学意义(P＞0.05).实验组10只兔眼中有6只眼角膜恢复透明,组织片在荧光显微镜下观察能发出绿色荧光,免疫组织化学结果显示CK8、CK18、CK12表达均为细胞质棕色染色,细胞核蓝染.对照组兔眼角膜均混浊、水肿,荧光显微镜下未见荧光,且部分角膜组织有CK8、CK18表达,无CK12表达.结论 EGFP基因修饰的人AECs构建的复层上皮细胞-角膜基质移植材料能较好地重建角膜缘干细胞缺乏的兔眼角膜表层,可能是组织工程角膜表层一种新的细胞来源.慢病毒载体是一种安全有效的基因转移工具.