人巨细胞病毒UL97基因耐更昔洛韦突变检测的研究

目的 了解造血干细胞移植受者人巨细胞病毒(HCMV) UL97基因耐更昔洛韦(GCV)突变情况.方法 前瞻性收集2008至2010年在北京大学人民医院血液病研究所行骨髓干细胞移植术后血浆HCMV DNA阳性时间至少持续2周的患者43例,其中男29例,女14例,平均年龄21岁.利用实时荧光定量PCR检测HCMV DNA的负荷,收集49份血浆标本检测UL97耐GCV突变.应用改进的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测UL97 M460V/I、H520Q、A591V、A594V、L595S/F及C603W共8种常见耐GCV突变；使用PCR直接测序法(PCR-DS)检测UL97耐GCV突变；建立扩增阻滞突变系统实时PCR方法(ARMS RT-PCR)检测UL97 A594V耐药突变.结果 PCR-RFLP分析方法未检测出8种已知的UL97耐GCV突变.PCR-DS方法未检测到已知的UL97耐GCV突变,新发现UL97 R494P、T502A、N558D及G561S突变.成功建立UL97 A594VARMS RT-PCR检测方法,结合核酸提取试剂的使用,其检测下限至少达7.5 ×102拷贝数/ml,检测筛选的临床标本发现2例患者为阳性,UL97 A594V耐药突变率为4.7％ (2/43).结论 构建的ARMSRT-PCR方法具有较高的敏感性,可用于临床监测UL97 A594V耐药突变.