人巩膜成纤维细胞体外三维胶原基质培养系统的构建及其生物力学特性

背景 眼轴的过度伸长和巩膜组织的扩张是高度近视发病机制研究的热点之一,建立合理的人巩膜成纤维细胞(HSFs)培养体系模型有助于进一步探讨HSFs在高度近视形成过程中与胶原基质相互作用的生物学机制. 目的 构建HSFs与Ⅰ型胶原的三维培养系统,微观模拟在体巩膜,建立巩膜重塑模型.方法 采集新鲜供体巩膜组织,采用组织块培养法分离和培养HSFs,采用免疫荧光技术检测细胞中波形蛋白和角蛋白的表达以鉴定细胞;获取8周龄SPF级雄性SD大鼠鼠尾腱制备鼠尾胶原,400μl胶原加入50μ1NaOH(0.1 mol/L)溶液中混匀,加入80μl 10倍培养液,混匀,溶液pH值约为7.加入1 100μl终浓度1×106/ml细胞悬液混合形成凝胶培养系统,于倒置相差显微镜下观察HSFs的增生情况和细胞形态,采用IPP-5软件对三维培养的含细胞胶原收缩面积进行测量以分析三维胶原系统的物理特性;采用生物力学试验机对三维胶原系统的生物力学特性进行测定.结果 培养的HSFs波形蛋白呈阳性表达,角蛋白表达阴性.未接种培养细胞的无成纤维细胞SD鼠鼠尾胶原凝胶透明,实验期间性状无明显变化,而含HSFs的三维胶原凝胶随着细胞培养时间的延长细胞数量增加,倒置相差显微镜下可观察到数十层成纤维细胞相互交错呈网状排列,培养后7 ～14d凝胶块呈乳白色,凝胶面积保持在正常的10％左右,三维培养系统中的HSFs接种后24 h细胞产生多向性突起,呈双极形或纺锤形.HSFs胶原凝胶复合物的弹性材料蠕变曲线呈非线性(0 ～ 100 s)部分与线性(100 ～600 s)部分,前者是胶原凝胶在短暂应力的作用下本身的弹性变化,后者是胶原凝胶在定力的作用下随拉伸时间的延长而出现的蠕变变化. 结论 鼠胶原凝胶对培养的HSFs有良好的生物相容性,HSFs胶原凝胶可形成三维复合物,可呈现机械性生物学特性,是研究成纤维细胞与细胞外基质之间以及细胞之间相互作用的良好模型,可用于巩膜重塑的模拟研究.