沉默表达miR-26a A549细胞株的构建

目的 构建稳定沉默表达miR-26a的人肺腺癌细胞株(A549).方法 体外合成成熟的人miR-26a-5p(Hsa-miR-26a-5p)特异性互补序列,在片段两侧添加Age I、EcoRI酶切位点,与经双酶切后的GV280载体连接,构建GV280-miR-26a-down慢病毒载体.应用DNA测序对此重组载体进行鉴定.将GV280-miR-26a-down慢病毒载体与病毒包装质粒pGC-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染293T细胞,包装产生慢病毒.依据293T细胞绿色荧光蛋白的表达量确定病毒滴度.将沉默表达miR-26a的慢病毒转染A549细胞,嘌呤霉素筛选后获得稳定细胞株.应用Western blot法检测miR-26a一个靶基因SMAD1的表达情况,验证此细胞株的功能.结果 经DNA测序鉴定,成功构建了GV280-miR-26a-down慢病毒载体.在293T细胞中将该载体包装成慢病毒,测定病毒滴度为2×1012 TU/L.重组慢病毒转染A549细胞的效率高达95％,用2.5 mg/L嘌呤霉素筛选2周后几乎100％的A549细胞表达GFP.Western blot结果显示miR-26a的靶基因SMAD1的表达量在miR-26a沉默组比空载病毒组和空白对照组明显上调.结论 成功构建了GV280-miR-26a-down慢病毒载体,并构建稳定沉默表达miR-26a的A549细胞株,为后续研究奠定了基础.