羟喜树碱对体外培养的人Tenon囊成纤维细胞自噬的诱导作用

背景 滤过道瘢痕化及人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)增生是抗青光眼滤过手术失败的主要原因.目前已有羟喜树碱诱导成纤维细胞凋亡及其机制的相关报道,但是羟喜树碱对HTFs自噬的影响鲜见报道. 目的 探讨羟喜树碱对体外培养的HTFs自噬的影响.方法 收集3例接受斜视手术患者的Tenon囊组织,以组织块培养法,用含体积分数10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基原代培养HTFs并传代,取第3～6代细胞进行培养.分别在培养基中加入0.0、0.5、1.0、4.0、10.0 mg/L羟喜树碱,继续培养HTFs 24 h,以细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测各组细胞的增生情况.选取4.0 mg/L羟喜树碱作用HTFs 24 h,用Cyto-ID自噬检测试剂盒进行荧光染色,观察各组细胞中自噬小体和自噬溶酶体成分的分布,用荧光显微镜和流式细胞仪分别对Cyto-ID染色阳性细胞数量及其荧光强度进行测定,并与对照组比较.用逆转录定量检测PCR(qRT-PCR)和Western blot法分别检测各组HTFs中自噬相关蛋白Beclin-1、自噬相关基因5(ATG-5)和微管相关蛋白1轻链3(LC-3)蛋白及其mRNA的相对表达水平.结果 随着羟喜树碱质量浓度的增加,HTFs细胞活力逐渐下降,0.0、0.5、1.0、4.0、10.0 mg/L羟喜树碱组HTFs细胞活力的总体差异有统计学意义(F=19.040,P＜0.001),1.0、4.0、10.0 mg/L羟喜树碱组HTFs的细胞活力均低于对照组,以10.0mg/L组最低,差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.01).qRT-PCR检测显示,4.0 mg/L羟喜树碱组HTFs中Beclin-1 mRNA、ATG-5mRNA和LC-3 mRNA的相对表达量分别是对照组的(3.225±0.346)、(2.839±0.418)和(3.761±0.224)倍,与对照组比较差异均有统计学意义(P=0.020、0.027、0.007).Western blot检测表明,4.0 mg/L羟喜树碱组HTFs中Beclin-1、ATG-5和LC-3蛋白表达的灰度值较对照组明显上升,LC-3Ⅱ/Ⅰ灰度值比值分别为0.965±0.159和0.275±0.860,差异均有统计学意义(P=0.003).Cyto-ID染色结果显示,4.0 mg/L羟喜树碱处理后,HTFs自噬阳性细胞的比例由未处理的(11.333±4.010)％上升到(55.000±9.013)％,差异有统计学意义(P=0.002).流式细胞仪检测表明,4.0 mg/L羟喜树碱处理后24 h Cyto-ID染色的平均荧光强度是对照组的(3.037±0.513)倍,差异有统计学意义(P=0.003).结论 羟喜树碱能诱导体外培养的HTFs发生自噬.