新生儿坏死性小肠结肠炎帕内特细胞的研究

目的 通过检测新生儿坏死性小肠结肠炎(necro tizing enterocolitis,NEC)中帕内特细胞(paneth cells,PCs)的数量及其分泌的抗菌肽(溶菌酶、α-防御素5、分泌型磷脂酶A2)蛋白及mRNA的水平改变,初步探讨PCs在NEC中的作用.方法 收集上海交通大学附属儿童医院2015年1月至2018年6月NEC患儿的外科手术小肠标本12例,胎龄和手术年龄匹配的对照组标本10例(肠扭转2例、梅克尔憩室2例、小肠闭锁6例).所有标本均取自手术样本边缘外观正常的区域,以避免使用坏死组织.采用AB/PAS染色及免疫组织化学检测的方法对PCs进行计数.采用免疫组织化学检测的方法观察PCs抗菌肽(溶菌酶、α-防御素5和分泌型磷脂酶A2等)的表达情况.采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction,qPCR)技术检测炎症因子以及PCs抗菌肽的mRNA表达.运用Image-J软件检测平均光密度值.均数采用t检验,统计学分析采用SPSS 22.0软件进行.结果 AB/PAS染色结果显示NEC组杯状细胞、PCs等着色较浅,数量减少;对照组肠道正常.免疫组织化学结果显示,溶菌酶、α-防御素5和分泌型磷脂酶A2蛋白主要表达于小肠隐窝底部,PCs胞质内,呈棕褐色;与对照组相比NEC组PCs表达的溶菌酶,α-防御素5和分泌型磷脂酶A2均降低,对照组三种蛋白平均光密度值分别为0.45±0.06、0.75±0.03和0.66±0.04,PCsNEC组三种蛋白的光密度值分别为0.05±0.02、0.22±0.04、和0.25±0.03,差异具有统计学意义(P＜0.05).蛋白质印迹法结果显示,与对照组相比NEC组PCs表达的溶菌酶、α-防御素5和分泌型磷脂酶A2均降低,对照组三种蛋白表达强度分别为0.58±0.14、0.76±0.05和0.83±0.09,NEC组三种蛋白表达强度分别为0.30±0.08、0.46±0.07和0.53±0.03,差异具有统计学意义(P＜0.05).NEC患儿病变穿孔肠道标本的PCs数目较对照组减少.对照组中,溶菌酶、α-防御素5与分泌型磷脂酶A2免疫组化计数的数值分别为2.8±0.29、2.5±0.27和2.7±0.26,而NEC组分别为0.67±0.19、0.7±0.26和0.5±0.15,差异具有统计学意义(P＜0.05).NEC组较对照组炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA有升高趋势,差异具有统计学意义(P＜0.05).NEC组溶菌酶、α-防御素5和磷脂酶A2 mRNA均较对照组减少,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 NEC患儿的小肠组织的PCs数目以及其分泌的抗菌物质较对照组减少.