病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ对293T细胞APOBEC3G表达的影响

目的 探讨病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)表达的影响及其机制.方法 转染vMIP-Ⅱ质粒(vMIP-Ⅱ质粒组)、空质粒(空质粒组)至293T细胞.定量PCR和Western印迹法分析转染vMIP-Ⅱ基因对293T细胞APOBEC3G表达的影响.空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组细胞分别加入1 000 IU/ml干扰素α(IFN-α),培养36 h后,Western印迹法检测空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+IFN-oα组APOBEC3G的蛋白水平.对转染vMIP-Ⅱ质粒的293T细胞,分别用75μmol/L JAK/STAT信号通路抑制剂AG490和20 μmol/LERK信号通路抑制剂U0126处理,24h后收集细胞总蛋白,Western印迹法检测APOBEC3G蛋白水平.构建包含APOBEC3G启动子的荧光素酶报告基因重组质粒,启动子片段包括APOBEC3G全长启动子序列(POS)与长度1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp序列及APOBEC3G启动子序列中不含调控元件的区域(NEG),将荧光素酶报告基因重组质粒和vMIP-Ⅱ质粒共转染293T细胞为实验组,以与空质粒共转染的293T细胞为对照,检测APOBEC3G启动子活性,分析vMIP-Ⅱ调控APOBEC3G转录活性的关键启动子作用区域.统计学比较采用t检验、单因素方差分析、LSD-t检验.结果 vMIP-Ⅱ转染组APOBEC3G mRNA、蛋白水平(2.500±0.013、1.472±0.013)均高于对照组(1、0.364±0.030,t值分别为6.22、6.54,均P＜0.05).空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+ IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+IFN-α组APOBEC3G水平(分别为1、2.030±0.108、2.700±0.081、2.600±0.099)差异有统计学意义(F=67.026,P＜0.001),vMIP-Ⅱ质粒组与空质粒+IFN-α组差异无统计学意义(t=3.46,P＞0.05).vMIP-Ⅱ质粒组、vMIP-Ⅱ质粒+AG490组、vMIP-Ⅱ质粒+U0126组APOBEC3G水平(0.617±0.025、0.179±0.061、0.359±0.012)差异有统计学意义(F=70.019,P＜0.001),后两组均低于vMIP-Ⅱ质粒组(t值分别为9.66、11.836,P＜0.01).荧光素酶活性检测显示,转染了POS、1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp及NEG序列的vMIP-Ⅱ质粒组启动子活性差异有统计学意义(F=81.092,P＜0.001),从720 bp片段至480 bp片段,APOBEC3G启动子活性降低幅度巨大.结论 vMIP-Ⅱ上调APOBEC3G的表达,可能是通过JAK/STAT信号通路或作用于APOBEC3G转录活性的关键启动子区域.