肺炎链球菌phpP基因重组表达及其产物PP2C型磷酸酶活性的研究

目的：构建肺炎链球菌StkP／PhpP信号偶联中磷酸酶编码基因phpP原核表达系统，了解表达产物rPhpP磷酸酶活性及类型。方法采用PCR扩增肺炎链球菌ATCC6306株phpP基因并测序。采用常规基因工程技术构建phpP基因原核表达系统。采用SDS-PAGE及凝胶图像分析系统检查rPhpP表达情况及其可溶性，Ni-NTA亲和层析法提纯rPhpP。实时荧光定量RT-PCR检测亚致死量青霉素和头孢噻肟药物作用后phpP基因转录水平变化。采用专业生物信息学软件分析phpP基因序列中磷酸酶功能结构域及其类型。采用丝／苏氨酸磷酸酶检测试剂盒检测rPhpP水解PP2C型磷酸酶活性并测定其酶动力学参数。结果克隆的phpP基因序列与GenBank报道序列完全相同。所构建的phpP基因原核表达系统表达可溶性rPhpP。亚致死量青霉素和头孢噻肟药物作用后phpP-mRNA水平升高。 phpP基因序列中含有PP2Cc磷酸酶结构功能域。提纯的rPhpP能水解PP2C型磷酸酶底物磷酸肽[RRA（pT）VA]且活性随rPhpP浓度增加而升高，其Km 和Kcat值分别为277．35μmol／L和0．71 S－1。结论肺炎链球菌phpP基因表达产物为PP2C型磷酸酶，亚致死量青霉素和头孢噻肟可诱导phpP基因表达上调。