脂多糖抑制小鼠肺成纤维细胞自噬的观察性研究

目的 观察体外原代培养的小鼠肺成纤维细胞在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用下,自噬微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1LC3)(以下简称LC3)和Beclin-1的表达情况,以明确LPS对肺成纤维细胞自噬的调控作用. 方法 将培养至4～7代的小鼠肺成纤维细胞接种于6孔培养板,密度1×104个/ml.待细胞贴壁后,更换无血清培养基饥饿过夜,采用随机数字表法将其分为4组(每组3孔):PBS对照组(Con组)、250μg/L LPS组(LPS250组)、500μg/LLPS组(LPS500组)、1 000 μg/L LPS组(LPS1000组),除Con组外,其余组分别加入以上终浓度LPS,各组在加入PBS或LPS后30 h裂解细胞并提取总蛋白,通过Western blot法比较小鼠肺成纤维细胞经不同浓度LPS刺激后LC3和Beclin-1蛋白的表达情况;同时,采用随机数字表法将传代细胞分为2组(每组3孔):IF-Con组(加入PBS作为对照)和IF-LPS组(加入1 000 μg/L的LPS),采用免疫荧光技术比较IF-Con组和IF-LPS组中小鼠肺成纤维细胞内自噬小体的表达情况. 结果 随着LPS刺激浓度的增高,LC3蛋白表达量下调,而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在Con组最高,随LPS刺激浓度的升高逐渐降低,LPS1000组中,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较Con组降低(P＜0.05);Beclin-1蛋白的表达量在Con组、LPS250组和LPS500组间差异无统计学意义(P＞0.05),而在LPS1000组中,Beclin-1蛋白表达较Con组明显下调(P＜0.05).同时,免疫荧光实验结果显示IF-LPS组中小鼠肺成纤维细胞内自噬小体的表达量较IF-Con组明显降低. 结论 在体外培养的小鼠肺成纤维细胞中应用1 000μg/L的LPS可以下调LC3和Beclin-1的蛋白表达,并抑制自噬小体的形成,表明LPS可以抑制肺成纤维细胞的自噬.提示LPS抑制肺成纤维细胞的自噬可能是肺纤维化发生的机制之一.