采用CRISPR knockin技术实现VEGF165定点敲入HEK293T细胞系的构建

目的 构建定点敲入血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的人肾上皮细胞系HEK293T,避免由慢病毒感染等方法实现过表达时所带来的脱靶效应.方法 根据EZH2基因的DNA序列设计、构建两端带有同源臂的VEGF165表达载体(pUCm-T-VEGF165质粒)和能定点切割基因组DNA的小向导RNA(sgRNA)表达载体[pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒],再将这两个质粒共转染HEK293T细胞,通过实时荧光定量PCR检测VEGF165和EZH2的mRNA表达情况,蛋白质印迹法(Western Blot)检测VEGF165和EZH2的蛋白表达情况.结果 实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示,与对照组、单独转染pUCm-T-VEGF165质粒和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组比较,共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA质粒组VEGF165的mRNA和蛋白相对表达量均升高(VEGF165 mRNA:3.42±0.30比1.02±0.21、1.13±0.16、0.98±0.18,均P<0.01;VEGF165蛋白:3.12±0.10比1.02±0.06、0.88±0.03、0.80±0.05,均P<0.01),EZH2的mRNA和蛋白相对表达量均降低(EZH2 mRNA:0.14±0.06比1.08±0.11、1.02±0.12、1.13±0.16,均P<0.01;EZH2蛋白:0.23±0.03比1.05±0.13、0.91±0.04、0.81±0.06,均P<0.01).该结果表明VEGF165基因被定点插入EZH2基因的基因组DNA序列中,并干扰了EZH2的表达.结论 采用CRISPR/Cas9系统成功构建了定点敲入VEGF165基因的HEK293T细胞系.