无需抽提RNA直接定量血浆microRNAs的实时荧光定量PCR方法的建立与评价

目的 建立无需抽提RNA直接以血浆中的microRNAs (miRNAs)作为模板进行实时荧光定量PCR检测的新方法.方法 方法学建立.采集健康人EDTA-K2抗凝静脉血并分离血浆,取7.5μl血浆用等量含2.5％(体积比)Tween20的缓冲液处理后进行逆转录及PCR,建立血浆miRNAs直接检测法.用该方法检测健康人血浆标本中U6 snRNA、miR-24-1-5p和miR-4634表达水平,评估其扩增的特异性和扩增效率.同时与传统的抽提RNA定量PCR检测法的阈值循环数(Cq)值进行比较并作相关性分析.另外,应用建立的血浆直接检测法,比较了混合引物和单个引物逆转录法检测健康人血浆标本中U6 snRNA、miR-24-1-5p和miR-4634结果的一致性.结果 血浆直接检测法融解曲线显示健康人血浆标本中U6、miR-24-1-5p和miR-4634扩增产物分别在81、83、84.2 qC时出现单一峰,无引物二聚体峰和其他非特异峰出现.血浆直接检测法检测miR-24-1-5p扩增效率为1.1,同一份样本中U6、miR-24-1-5p和miR-4634这3种基因的扩增曲线平行,说明扩增斜率一致.直接检测法检测miR-4634的Cq值为30.98±0.17,高于RNA抽提法的29.22±0.21,差异有统计学意义(t=8.475,P＜0.01),而2种方法检测U6(直接检测法32.43±0.08,RNA抽提法32.57±0.06;t=1.354,P＞0.05)、miR-24-1-5p(直接检测法20.73±0.14,RNA抽提法21.06±0.21；t=1.749,P＞0.05)结果差异均无统计学意义.2种方法检测U6(r=0.860 5,P＜0.01)、miR-24-1-5p(r=0.728 9,P＜0.05)和miR-4634(r=0.748 5,P＜0.01)结果具有较好的相关性.混合引物和单个引物逆转录后PCR的Cq值之间无明显差异.结论 建立的血浆直接检测法只需对血浆标本进行简单的预处理,并可使用混合引物进行逆转录定量PCR,具有操作简便、检测成本低等优点,值得进一步推广应用.