调控自噬对二氢青蒿素诱导膀胱癌细胞凋亡的影响

目的 观察二氢青蒿素(DHA)和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联合用药抑制膀胱癌T24细胞增殖并探讨其机制.方法 采用不同浓度(0、12.5、25.0、50.0、100.0μmol/L)的DHA及加入自噬抑制剂3-MA(5 mmol/L)分别处理膀胱癌T24细胞24、48、72 h后,通过噻唑蓝(MTT)实验分析细胞存活率,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot检测凋亡标记蛋白半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3酶原(procaspase-3)、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(t-PARP)和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶降解产物(cleaved-PARP)的表达水平.50.0 tμmol/L DHA作用于膀胱癌T24细胞24 h后,丹酰戊二胺(MDC)染色后采用荧光显微镜对自噬进行形态观察,透射电子显微镜观察白噬体超微结构,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin-1和p62的表达.结果 DHA抑制膀胱癌T24细胞的增殖并诱导其凋亡,作用呈浓度和时间依赖性(12.5 μmol/L的DHA 24、48、72 h抑制率依次是5.79％、6.61％、11.09％;25.0 μmol/L的DHA 24、48、72 h抑制率依次是11.25％、15.32％、21.35％;50.0 μmol/L的DHA 24、48、72 h抑制率依次是27.16％、30.66％、47.58％;100.0μmol/L的DHA 24、48、72 h抑制率依次是41.52％、57.52％、74.29％;12.5 μmol/L的DHA 24、48、72 h死亡率依次是3.66％ 、6.44％ 、9.78％;25.0 μmol/L的DHA 24、48、72 h死亡率依次是7.02％、13.40％、17.55％;50.0 μmol/L的DHA 24、48、72 h死亡率依次是20.53％、26.97％、38.69％;100.0 μ.mol/L的DHA 24、48、72 h死亡率依次是29.82％、39.26％、44.92％),与空白对照组比较差异有统计学意义(P=0.003);与空白对照组、3-MA和DHA单药组比较,自噬抑制剂3-MA和DHA联合用药可增加膀胱癌细胞的凋亡率.荧光显微镜下观察到MDC荧光染色阳性的自噬泡呈点状结构分布在细胞核的胞质内.透射电子显微镜下观察到多个双层膜包裹胞质形成的自噬体.DHA处理膀胱癌T24细胞后,自噬相关蛋白LC3、Beclin-1及凋亡标记蛋白cleaved-PARP的表达量增加,而自噬相关蛋白p62和凋亡标记蛋白procaspase-3、t-PARP表达水平降低;加入自噬抑制剂3-MA后,与对照组比较,cleaved-PARP的表达量增加及procaspase-3、t-PARP表达水平降低这一趋势更加明显.结论 DHA可抑制膀胱癌细胞的增殖并诱导其凋亡及产生自噬现象,且自噬在细胞凋亡过程中对癌细胞起保护性作用.