微小RNA-433调控组蛋白去乙酰化酶6抑制胶质瘤增殖与侵袭

目的 探讨脑胶质瘤组织中微小RNA(miR)-433、组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)的表达水平及miRNA-433对脑胶质瘤细胞增殖、侵袭的影响和作用机制.方法 (1)收集新乡医学院第一附属医院神经外科自2010年1月至2014年12月手术切除并经病理检查证实的脑胶质瘤标本42例(低级别14例,高低级别28例),另外选取同期因颅脑外伤手术切除的正常脑组织标本13例.采用RT-PCR检测脑胶质瘤组织和正常脑组织miRNA-433、HDAC6 mRNA的表达.(2)体外常规培养脑胶质瘤U251细胞,分为空白对照组、无义序列对照组和miRNA-433模拟物组,后2组分别转染无义序列和miRNA-433模拟物,空白对照组不做处理.RT-PCR检测细胞miRNA-433和HDA C6、P21 mRNA的表达.CCK-8法检测培养1～5 d时的细胞存活率.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率.Transwell实验检测细胞的侵袭能力.Western blotting检测细胞HDAC6蛋白的表达.(3)构建野生型(WT)HDAC63'-UTR、突变型(MUT)HDAC63'-UTR荧光报告载体.将miR-433模拟物+WT HDAC63'-UTR、无义序列+WT HDAC63'-UTR分别转染U251细胞,双荧光素酶实验检测2组细胞的荧光强度.将miR-433模拟物+MUT HDAC63'-UTR、无义序列+MUT HDAC63'-UTR分别转染U251细胞,双荧光素酶实验检测2组细胞的荧光强度.(4)将U251细胞分为无义序列对照组、HDAC6表达质粒组、HDAC6 siRNA组,分别转染无义序列、HDAC6表达质粒和HDAC6 siRNA后RT-PCR检测细胞P21、HDA C6 mRNA及miRNA-433的表达.将U251细胞分为miR-433模拟物组、miR-433模拟物+HDAC6表达质粒组,分别转染miR-433模拟物、miR-433模拟物+HDAC6表达质粒后1～5 d时采用CCK-8法检测细胞存活率.结果 (1)高级别脑胶质瘤、低级别脑胶质瘤、 正常脑组织中miRNA-433的表达水平逐渐增高,HDA C6 mRNA的表达水平逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.05).脑胶质瘤组织中二者的表达呈负相关关系(r=0.829,P=0.000).(2)与空白对照组和无义序列对照组比较,miRNA-433模拟物组U251细胞miRNA-433、P21 mRNA表达水平升高,HDA C6 mRNA表达水平降低,培养2～5 d时细胞存活率降低,G0/G1期细胞所占比例增高,细胞凋亡率升高,穿膜细胞数减少,HDAC6蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05).(3)miR-433模拟物+WT HDAC63'-UTR组细胞的荧光素酶活性明显低于无义序列+WT HDAC63'-UTR组,差异有统计学意义(P<0.05);miR-433模拟物+MUT HDAC63'-UTR组和无义序列+MUT HDAC63'-UTR组细胞的荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05).(4)HDAC6 siRNA组、 无义序列对照组、HDAC6表达质粒组细胞HDAC6 mRNA的表达水平逐渐增高,P21 mRNA的表达水平逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05).培养2～5 d时,miR-433模拟物+HDAC6表达质粒组细胞存活率高于miR-433模拟物组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 miRNA-433在脑胶质瘤组织中呈低表达水平,过表达miRNA-433可能通过调控HDAC6抑制脑胶质瘤细胞的侵袭、增殖,并促进细胞凋亡.