低氧预处理大鼠脂肪源性间充质干细胞条件培养基对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响

目的:探讨低氧预处理大鼠脂肪源性间充质干细胞(ADSC)条件培养基对全层皮肤缺损大鼠创面愈合的影响。方法:(1)取6周龄雄性SD大鼠1只，颈椎脱臼处死，分离双侧腹股沟脂肪组织，胶原酶消化法提取第3代ADSC，观察细胞形态后用于后续实验。取细胞，采用随机数字表法(分组方法下同)分为成脂诱导组和成骨诱导组，每组各6孔。成脂诱导组培养14 d观察成脂情况，成骨诱导组培养28 d观察成骨情况。(2)取第3代ADSC，分为常氧组和低氧组，常氧组细胞置于氧气体积分数20%的常氧培养箱中培养，低氧组细胞置于氧气体积分数2%的低氧培养箱中培养。常氧组培养3 h，低氧组培养3、6、12、24、48 h，分别取3个样本，进行后续指标检测。实时荧光定量反转录PCR检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的mRNA表达量。收集2组细胞培养上清液，离心过滤后获得常氧条件培养基(normo-CM)和低氧条件培养基(hypo-CM)，酶联免疫吸附测定法检测条件培养基中VEGF、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF)含量。(3)取27只6～8周龄雄性SD大鼠，分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、normo-CM组和hypo-CM组，每组9只，在其背部制作直径为1 cm的圆形全层皮肤缺损创面并分别滴加50 μL PBS、normo-CM及hypo-CM。伤后0、3、5、7、9、11 d，观察创面大体情况，测量创面面积并计算创面未愈合率。取创面组织，苏木精-伊红染色观察伤后3、9、11 d创面炎症反应及伤后9 d创面再上皮化水平；Masson染色观察伤后11 d创面胶原沉积情况，并分析胶原容积分数(CVF)。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、 t检验、Bonferroni校正。 结果:(1)细胞融合度低时呈长梭形、贴壁生长、排列紧密。培养14 d，成脂诱导组细胞经油红O染色后被染成红色的脂滴。培养28 d，成骨诱导组细胞经茜素红S染色后可见红色结节。细胞鉴定为ADSC。(2)与常氧组比较，低氧组细胞培养12、24 h HIF-1α mRNA表达量明显升高( t＝5.43、5.11， P<0.05)；培养6、12 h VEGF mRNA表达量明显升高( t＝3.29、2.33， P<0.05或 P<0.01)；bFGF mRNA培养12 h表达量明显升高( t＝12.59， P<0.01)，培养48 h明显降低( t＝9.34， P<0.01)；培养3、12、24 h PPAR-γ mRNA明显降低( t＝5.14、6.56、4.97， P<0.05)。(3)与常氧组相比，低氧组细胞培养3、6、12、24、48 h VEGF含量明显升高( t＝5.74、12.37、14.80、15.70、34.63， P<0.05或 P<0.01)，培养6、12、24、48 h IGF含量明显升高( t＝5.65、8.06、20.12、22.99， P<0.05或 P<0.01)，培养各时间点TGF-β和EGF含量无明显变化。(4)伤后0～11 d，3组大鼠创面均不同程度缩小，未见明显感染、渗出等。伤后11 d，PBS组大鼠创面面积仍较大；normo-CM组大鼠创面面积较PBS组缩小，hypo-CM组大鼠创面已基本愈合。伤后7 d，normo-CM组和hypo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组( t＝10.26、16.03， P<0.05)。伤后9 d，hypo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组和normo-CM组( t＝17.25、6.89， P<0.05或 P<0.01)，normo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组( t＝8.81， P<0.05)。伤后11 d，hypo-CM组大鼠创面未愈合率为(2.4±1.5)%，明显低于PBS组的(20.0±5.0)%和normo-CM组的(7.7±1.7)%， t＝30.15、84.80， P<0.05。(5)伤后3 d，hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润明显多于其余2组；伤后9 d，normo-CM组和hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润均少于PBS组；伤后11 d，hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润明显少于PBS组和normo-CM组。(6)伤后9 d，hypo-CM组大鼠创面"表皮迁移舌"长度长于其他2组，表皮厚度接近正常皮肤。伤后11 d，与PBS组和normo-CM组相比，hypo-CM组大鼠创面中可见大量结构致密、排列整齐、成熟度较高的胶原沉积。PBS组大鼠创面CVF为(22.90±1.25)%，显著低于normo-CM组的(31.96±0.14)%和hypo-CM组的(56.10±1.50)%( t＝12.48、29.43， P<0.05)；normo-CM组大鼠创面CVF显著低于hypo-CM组( t＝27.73， P<0.05)。 结论:低氧处理可显著增强大鼠ADSC的旁分泌作用，低氧预处理的大鼠ADSC条件培养基可通过调控炎症细胞浸润程度、促进创面再上皮化和胶原沉积，加速大鼠全层皮肤缺损创面愈合。