小鼠视黄酸刺激基因8(Stra8)的原核表达及兔多克隆抗体的制备与鉴定

目的 原核表达小鼠视黄酸刺激基因8(Stra8)蛋白并制备兔抗小鼠Stra8多克隆抗体.方法 应用分子克隆法构建pET28a-Stra8原核表达重组质粒,将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Stra8蛋白表达,采用组氨酸标签(His-TAG)亲和层析柱纯化原核蛋白.以纯化后的Stra8蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,制备Stra8多克隆抗体.ELISA测定多克隆抗体的效价,Western blot法检测制备的抗体对睾丸组织Stra8蛋白的识别能力以确定其有效性,免疫荧光组织化学染色法检测睾丸组织中Stra8蛋白的表达以确定多克隆抗体的特异性.结果 pET28a-Stra8重组质粒经双酶切和测序鉴定正确,经诱导后能高效表达Stra8蛋白,应用His-TAG亲和层析法获得纯度较高的Stra8蛋白.应用纯化的Stra8蛋白连续免疫新西兰大白兔5次后,提取抗血清,经ELISA检测获得的Stra8多克隆抗体效价为1:106,Western blot法分析显示多克隆抗体可特异性地识别睾丸组织中的内源性Stra8蛋白,免疫荧光染色法显示该多克隆抗体能够特异性的识别小鼠睾丸组织精原细胞表达的Stra8蛋白.结论 在大肠杆菌中有效地诱导表达Stra8原核蛋白并制备了特异性的兔抗Stra8多克隆抗体.