骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞的定向分化

目的:神经反射通路的重建和再髓鞘化是影响脊髓损伤后恢复的一个关键性因素,而少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化.探讨骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化的可行性.方法:实验于2006-09/2007-06在同济医院骨科实验室完成.①动物:2~4周龄清洁级SD大鼠5只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:大鼠颈脱臼法处死,无菌条件下取双侧股骨、胫骨,去除两端骨骺,暴露骨髓腔,用DMEM培养液反复冲洗,收集冲洗液,重悬细胞种植于25 cm2培养瓶中,培养体系中含DMEM、体积分数为0.1的胎牛血清、终浓度为2 mmol/L谷氨酰胺及100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素,采用贴壁法+胰蛋白酶消化法进行纯化.取培养至第4代的骨髓间充质干细胞,加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、N2添加剂的无血清培养基进行诱导分化.③实验评估:观察诱导过程中骨髓间充质干细胞的形态学变化.半定量RT-PCR检测少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达.应用抗微管相关蛋白、抗神经纤维酸性蛋白、抗半乳糖脑苷脂、抗磷脂碱性蛋白抗体进行免疫细胞化学染色,检测骨髓间充质干细胞定向分化为少突胶质细胞的阳性率.结果:①骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化:经诱导分化后,大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征,胞质向细胞核回缩,细胞突起向外延伸,折光性增强,随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构.②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达:细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带.③少突胶质细胞阳性率:在诱导分化条件下,半乳糖脑苷脂阳性率为65%,磷脂碱性蛋白阳性率为45%,微管相关蛋白2阳性率为10%.结论:碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子与胰岛素样生长因子联合应用,能够有效促进骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化.