Modulation of Host Death by Chlamydia trachomatis — the Role of the Chlamydia-specific Protease CPAF

1 Abstract Chlamydia is confirmed to modulate host cell death pathways to complete its own developmental cycle. A balance between proand antiapoptotic influences by Chlamydia has been postulated. In this study, the effect of Chlamydia trachomatis on activation of host cell death pathways was investigated. C. trachomatis infection induced caspase-3-independent cell death, without the stimulation of apoptotic factors like cytochrome c and apoptotic induction factor (AIF). On the other hand, after treatment with staurosporine, the activated caspase-3 and the subsequent apoptotic nuclear fragments displayed in uninfected cells were inhibited by chlamydial infection. Poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) is known to play an important role on regulating apoptosis and necrosis. During necrosis, it will be over-activated and degraded differently from that observed during apoptosis, which exhibited the signature of 89 kDa and 24 kDa fragments. After Chlamydia infection, however, PARP-1 was cleaved to necrotic-like multi-fragment independent of caspase-3 activation. Strikingly, this cleavage was accompanied by a highly decreased enzymatic activity. PARP-1 silencing by siRNA in the host cells resulted in cell death similar to that induced by Chlamydia infection, but has no effect on chlamydial replicaction. Chlamydial but not host cell protein synthesis contributed to this PARP-1 cleavage. Cell free degradation assay confirmed that this proteolytic activity only existed in cytosolic extractions of infected cells. The purified proteolytic protein fraction after column chromatography exhibited a 29 kDa fragment by Coomassie staining. 2D gel electrophoresis combined with mass spectrometry proved that this 29 kDa fragment corresponds to the NH2-terminal portion of chlamydial proteolytic activity factor (CPAF). The high mobility group box-1 (HMGB-1) protein, which is known to be released to the extracellular matrix to induce inflammation during necrotic cell death, was also degraded by CPAF in the late stage of the chlamydial infectious cycle. This gives the suggestion that Chlamydia may evade the host immune system by degrading this inflammatory factor. Under the stressful conditions like exposure to IFN-γ, C. trachomatis underwent a special form so called “persistence”, which is characterized by enlarged pleomorphic RBs and reduced inclusion size, with minimal cultivability and low infectivity. The persistent Abstract 2 Chlamydia also exhibited the ability of apoptosis inhibition which ensures the long-term persistence in host cells. During persistent chlamydial infection, the nuclear proteins PARP-1 and HMGB-1 were not degraded, whereas cell free degradation assays with the cytosolic extraction from persistently infected cells showed the activity to cleave both proteins, suggesting the CPAF translocation to the host nucleus was inhibited during persistence. The pro-apoptotic BH-3 proteins, degraded by CPAF during active infection, were only slightly degraded during persistence. RT-PCR gave the evidence that the expression of CPAF was highly decreased during persistent infection. Our results gave the convincible evidence that the Chlamydia-secreted protease CPAF, as a ubiquitous protease in Chlamydia-infected cells, plays an important role in the regulation of host cell death pathways and fulfilling the requirements for chlamydial developmental cycle. During active infection this protease degrades many host factors, on the one hand, cleavage of nuclear proteins could induce the host cell instability and subsequent cell death, on the other hand, the degradation of pro-apoptotic BH-3 protein protect the infected cells against apoptotic stimuli. For the long-term persistence in host cells, Chlamydia highly decreases the expression of CPAF, which only existed in the cytosol but is not translocated to the nucleus. The nuclear proteins kept intact which may make sure the stability of the host cells, whereas slight degradation of pro-apoptotic BH-3 protein still support the persistent infection resistance to apoptosis.2 Chlamydia also exhibited the ability of apoptosis inhibition which ensures the long-term persistence in host cells. During persistent chlamydial infection, the nuclear proteins PARP-1 and HMGB-1 were not degraded, whereas cell free degradation assays with the cytosolic extraction from persistently infected cells showed the activity to cleave both proteins, suggesting the CPAF translocation to the host nucleus was inhibited during persistence. The pro-apoptotic BH-3 proteins, degraded by CPAF during active infection, were only slightly degraded during persistence. RT-PCR gave the evidence that the expression of CPAF was highly decreased during persistent infection. Our results gave the convincible evidence that the Chlamydia-secreted protease CPAF, as a ubiquitous protease in Chlamydia-infected cells, plays an important role in the regulation of host cell death pathways and fulfilling the requirements for chlamydial developmental cycle. During active infection this protease degrades many host factors, on the one hand, cleavage of nuclear proteins could induce the host cell instability and subsequent cell death, on the other hand, the degradation of pro-apoptotic BH-3 protein protect the infected cells against apoptotic stimuli. For the long-term persistence in host cells, Chlamydia highly decreases the expression of CPAF, which only existed in the cytosol but is not translocated to the nucleus. The nuclear proteins kept intact which may make sure the stability of the host cells, whereas slight degradation of pro-apoptotic BH-3 protein still support the persistent infection resistance to apoptosis. Zusammenfassung 3 Zusammenfassung Chlamydien sind obligat intrazelluläre Bakterien, die die Zelltod-Signalwege ihrer Wirtszellen modulieren, um ihren eigenen Eintwicklungszyklus vollenden zu können. Es wurde ein Gleichgewicht zwischen zelltodinduzierenden und –inhibierenden Einflüssen von Chlamydien postuliert. In dieser Studie wurde der Effekt von Chlamydia trachomatis auf die Aktivierung der Zelltod-Signalwege der Wirtszelle untersucht. Die Infektion von HeLa-Zellen mit C. trachomatis induzierte einen Caspase-3-unabhängigen Zelltod ohne Stimulierung verschiedener apoptotischer Faktoren, wie Cytochrom c und Apoptose-Induktions-Faktor (AIF). Auf der anderen Seite inhibierte die chlamydiale Infektion die durch Staurosporin verursachte Caspase-3-Aktivierung und die anschließende Bildung apoptotischer nukleärer Fragmente. Poly (ADP-ribose) Polymerase-1 (PARP-1) spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Apoptose und Nekrose. Während eines nekrotischen Zelltodes ist sie überaktiviert und zeigt nachfolgend ein anderes Degradierungsmuster im Vergleich zur Apoptose, welche durch die Spaltung von PARP-1 in 89 und 24 kDa-Fragmente gekennzeichnet ist. Nach Infektion mit Chlamydien hingegen wurde PARP-1 in mehrere Fragmente gespalten und zeigte ein Caspase-3-unabhängiges Muster. Auffallend war, dass diese Spaltung mit einer starken Reduktion der enzymatischen Aktivität einherging. Die Inhibition der PARP-1Synthese in HeLa-Zellen mit Hilfe von siRNA induzierte einen Zelltod. Diese Ergebnisse weisen auf eine Rolle der PARP-1-Degradation bei der Induktion eines Zelltodes durch Chlamydien hin. Die Spaltung von PARP-1 ist abhängig von der chlamydialen Proteinsynthese, jedoch nicht von der Wirtszellproteinsynthese. Proteolytische Assays im zellfreien System bestätigten, dass diese Aktivität nur in cytosolischen Extrakten infizierter Zellen existierte. Durch Säulenchromatographie aufgereinigte proteolytische Fraktionen von cytosolischen Extrakten zeigten nach Coomassie-Färbung ein 29 kDa-Fragment. Die Analyse mittels 2DGelelektrophorese und Massenspektrometrie bewiesen, dass dieses 29 kDa-Fragment dem NH2-terminalen Teil des chlamydial proteolytic activity factor (CPAF) entspricht. Das high mobility group box-1 (HMGB-1) Protein, welches während eines nekrotischen Zelltods in die extrazelluläre Matrix abgegeben wird und als proinflammatorischer Faktor wirkt, wurde während der späten Phase des chlamydialen Infektionszyklus ebenfalls durch Zusammenfassung 4 CPAF degradiert. Durch die HMGB-1-Degradation könnten Chlamydien der Entzündungsreaktion und Abwehrmechanismen des Immunsystems entgehen. Unter Stressbedingungen, z. B. der Stimulation von infizierten Zellen durch IFNγ, können Chlamydien intrazellulär persistierende Formen entwickeln. Diese sind durch vergrößerte, pleomorphe Retikularkörperchen charakterisiert, welche sich kaum noch replizieren und sich nicht in infektiöse Formen umwandeln. Diese Chlamydienformen zeigten ebenfalls die Fähigkeit zur Inhibition der Apoptose, welche offensichtlich die Langzeit-Persistenz in den Wirtszellen gewährleistet. Während der persistenten chlamydialen Infektion wurden die nukleären Proteine PARP-1 und HMGB-1 nicht degradiert. Zellfreie proteolytische Assays zeigten hingegen, dass der cytosolische Extrakt persistent infizierter Zellen beide Proteine spalten konnte. Dies deutet darauf hin, dass die Translokation von CPAF in den Zellkern der Wirtszelle während der Persistenz unterdrückt wird. Die proapoptotischen BH3-Proteine, welche während der replikativen Infektion durch CPAF abgebaut wurden, waren während der Persistenz nur geringfügig degradiert. Mittels RT-PCR konnte bewiesen werden, dass die Expression von CPAF während der Persistenz stark reduziert war. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die durch Chlamydien sezernierte Protease CPAF eine wichtige Rolle bei der Regulation von Zelltod-Signalwegen der Wirtszelle und bei der Komplettierung des chlamydialen Entwicklungszyklus spielt. Während der aktiven Infektion spaltet diese Protease eine Reihe von Wirtszellproteinen. Einerseits kann die Spaltung von Kernproteinen zur Instabilität der Wirtszelle und zum anschließenden Zelltod führen. Andererseits schützt die Degradation von proapoptotischen BH3-Proteinen die infizierten Zellen g