副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法的建立与应用

[目的]建立一种可快速检测副猪嗜血杆菌的环介导等温扩增(LAMP)方法.[方法]根据GenBank中副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白(PalA)基因序列,在其保守区域设计外引物、内引物和环引物用于LAMP检测.优化副猪嗜血杆菌LAMP检测的反应体系,在反应产物中加入SYBR Green Ⅰ,对检测结果进行肉眼判定,建立副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法,评价该检测方法的特异性、敏感性.用建立的副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法对临床分离的8株不同血清型副猪嗜血杆菌进行检测.从疑似患副猪嗜血杆菌病的猪体内采集10种体液,用所建立的可视化LAMP检测方法进行检测.[结果]建立了副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法,该法在55℃水浴1h即可对副猪嗜血杆菌核酸进行高效扩增,反应结束后加入SYBR Green Ⅰ即可通过肉眼观察对结果进行判断.该方法具有很强的特异性,其对DNA核酸的最低检测限为40 fg,是常规PCR检测最低限的100倍,显示出较高的敏感性;用建立的LAMP方法对8株不同血清型副猪嗜血杆菌进行检测,结果均为阳性.用建立的LAMP方法对10种体液进行检测,结果鼻液、气管液、胸腔渗出物、心脏血、脑膜液、腹腔液和关节囊液呈阳性,唾液、心包液和尿液呈阴性.[结论]建立了一种可对副猪嗜血杆菌进行快速检测并可凭肉眼判定结果的可视化LAMP方法,该法操作简便、反应快速、敏感性强、特异性高,适合在兽医基层进行推广应用.