重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的 建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法(RAA).方法 以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列,设计、合成、筛选特异性引物和探针,建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法.分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性;通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增,初步评价其检测现场样本的能力.结果 成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法,其可在39℃20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增.以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板,该方法最低检出限为10拷贝/μL;以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板,该方法最低检出限为3 pg/μL;以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板,检测结果均为阴性.该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本,具备较好的现场样本检测能力.结论 成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法.