实时荧光重组酶聚合酶扩增在白色念珠菌检测中的初步应用

目的 探讨实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)在白色念珠菌检测中的初步应用效果.方法 (1)取1 mL白色念珠菌标准株及阴性对照菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、光滑念珠菌标准株菌液,使用酵母/细菌基因组试剂盒提取DNA.分析PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠菌的特异性.(2)取1株白色念珠菌标准株,以光滑念珠菌为阴性对照菌,复苏摇菌并计数,10倍倍比稀释为1×107～1×101集落形成单位(CFU)/mL,同实验(1)提取DNA,分析PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠球菌的灵敏性.统计实时荧光定量PCR扩增曲线达到阈值所需循环数及实时荧光RPA出现特异性扩增曲线所需时间,并与PCR结果进行比对.统计3种方法对白色念珠菌的检出下限及检出率,分析实时荧光RPA中白色念珠菌浓度与检测时间之间的相关性.(3)取1株白色念珠菌标准株,同实验(1)提取DNA,分别行PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA,统计3种方法检测总时长.(4)取31份疑似感染白色念珠菌的临床样本和1份棉拭子取材的白色念珠菌临床样本提取DNA,进行PCR与实时荧光RPA,统计阳性检出率.分别采用酵母/细菌基因组试剂盒、chelex-100加热煮沸法、液氮反复冻融法提取上述2种方法检测均出现阳性结果的临床样本的DNA.同前行实时荧光RPA检测(以光滑念珠菌为阴性对照菌)和PCR检测,阴性对照菌同实验(1),观察2种方法检测是否出现阳性结果,并统计实时荧光RPA中扩增曲线达到荧光阈值所需时间.对数据行线性相关分析和t检验. 结果 (1)3种方法检测中白色念珠菌均出现阳性结果,5种阴性对照菌均未出现阳性结果.(2)白色念珠菌菌液浓度越低,实时荧光定量PCR中扩增曲线达到阈值所需循环数越多,实时荧光RPA中出现特异性扩增曲线所需时间越长,PCR中凝胶条带的亮度越弱,3种检测方法中阴性对照菌均未出现相应的阳性结果.实时荧光RPA、PCR与实时荧光定量PCR中白色念珠菌的检出下限均为1×101 CFU/mL.实时荧光RPA中白色念珠菌浓度与检测时间呈明显负相关,r=-0.95,P＜0.01.PCR与实时荧光定量PCR对1×101～1×107 CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率均为100％.实时荧光RPA对1×101 CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率为78％,对1×102 ～1×107 CFU/mL的白色念珠菌的阳性检出率均为100％.(3)PCR、实时荧光定量PCR、实时荧光RPA检测白色念珠菌的总时间分别为133、93、35 min.(4)实时荧光RPA对31份疑似感染白色念珠菌临床样本的阳性检出率为32.26％(10/31),低于PCR的35.48％(11/31).11份临床样本经实时荧光RPA与PCR检测均出现阳性结果,阴性对照菌均未出现阳性结果.采用酵母/细菌基因组提取试剂盒、chelex-100加热煮沸法提取DNA进行实时荧光RPA,扩增曲线达到阈值所需时间分别为(438±13)、(462±12)s,二者相近(t=1.32,P＞0.05).液氮反复冻融法提取DNA进行实时荧光RPA,扩增曲线达到阈值所需时间为(584±15)s,明显长于另外2种方法(t =7.55、6.39,P＜0.01). 结论 实时荧光RPA检测白色念珠菌具有检测快速、操作简单、灵敏性高、特异性好等优点,值得临床推广应用.