CPC乙酰化酶底物结合区域Loop上脯氨酸对其催化特性的影响

低温CPC乙酰化酶在7-ACA的生物合成中具有重要作用和显著的优势,开发低温CPC乙酰化酶具有重大的经济价值.为了获得在低温下具有更高催化活性的CPC乙酰化酶,在前期的研究基础上,以先前获得的CA ⅢM为亲本,借助分子对接的手段确定了它的底物结合区域,并利用pyMOL软件找出了底物结合区域Loop上关键的脯氨酸残基,分析后将选定的脯氨酸用甘氨酸进行替换.借助pET32a质粒在E.coli BL21(DE3)中进行了可溶性表达研究,除P272G外,其它突变体均实现了可溶性表达.P238G、P582G和P679G在13℃对CPC的催化活性分别为1.25、1.04和1.38U/mg,较亲本的0.85 U/mg有了显著的提高.此外,分别考察了亲本及突变体的温度稳定性,它们之间无明显的差异.然后,在13℃下进行了7-ACA低温生物合成的研究,结果表明反应24h后CPC的转化率也能达到80％以上.由此可见在CPC乙酰化酶冷适应性改造方面取得了较为理想的结果,为进一步的改造及应用奠定了坚实的基础,也为其它低温酶的创制提供了可资借鉴的经验.