应用半乳糖表型差异高效筛选α-1,3半乳糖苷转移酶基因缺失的猪成纤维细胞

[目的]筛选α-1,3半乳糖苷转移酶(α1,3 galactosyl transferase,GGTA1)基因缺失的猪成纤维细胞.[方法]用同源重组载体pBS-GGTA1-SKO和pBS-GGTA1-DKO电转染GGTA1单等位基因敲除(GGTA1+/-)的五指山小型猪胎儿成纤维细胞,利用磁激活细胞分选(MACS)、MACS联合流式细胞术(FACS)、TcdA联合FACS等3种方法进行细胞筛选;对MACS筛选获得的单细胞克隆进行PCR和FACS鉴定,对MACS联合FACS、TcdA联合FACS获得的细胞集落进行PCR鉴定.[结果]经MACS筛选获得了11个细胞克隆,经鉴定2个是GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为18.2％;MACS联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定无GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为0;TcdA联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定均为GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为100％.[结论]MACS法筛选和TcdA联合FACS法筛选这2种方法均可以高效筛选出GGTA1双等位基因缺失的猪成纤维细胞,可用于进一步制备供异种器官移植的基因修饰小型猪.