酮古龙酸菌Y25 D-2-羟酸脱氢酶的表达、纯化与酶学性质

目的：克隆酮古龙酸菌D-2-羟酸脱氢酶（2-hydroxyacid dehydrogenase ， HADH）基因hadh，并在大肠杆菌中进行表达、纯化和酶学性质检测。方法 PCR扩增酮古龙酸菌D-2-羟酸脱氢酶基因hadh，构建表达载体pTIG-hadh，转化大肠杆菌BL21（DE3），对重组菌进行诱导表达，表达产物经Ni＋亲和层析柱进行纯化后进行酶学性质检测。结果 SDS-PAGE分析结果显示，重组菌中HADH表达量可达菌体总蛋白的50％以上，相对分子质量约35×103。酶学性质检测结果表明，纯化的HADH以2-酮基古龙酸（2-keto-gulonic acid，2-KGA）为底物，最适pH 8．0，最适温度45℃，几种常见金属离子和螯合剂对HADH的活性影响微弱或无影响，以2-KGA为底物时的HADH最大反应速度27 U/mg，Km值为2．6 mmol/L，体内酶活检测结果表明，HADH能够代谢2-KGA。结论重组HADH在大肠杆菌中获得了高效表达，并研究了其酶学性质，为后续山梨糖代谢通路研究和进一步提高糖酸转化率奠定了基础。