HIF-1α和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒载体,探讨其在脊髓损伤中的作用.方法 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法扩增目的基因HIF-1 α并亚克隆到含有报告基因EGFP的pShuttle-CMV-EGFP穿梭载体中,得到pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒.将已构建的重组穿梭质粒转移至pAdeno骨架载体上,获得pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后进行PCR鉴定并测定病毒滴度.结果 pShuttle-EGFP-HIF-1α经KpnI/BamHI双酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组在2.5 kb和5.1 kb处出现两条带,而阴性克隆组只有5.1kb处一条带,证明pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒构建成功;pShuttle-EGFP-HIF-1 α重组穿梭质粒与pAdeno载体重组后,经XhoI单酶切后琼脂糖凝胶电泳可见阳性克隆组出现14.5 kb,11.7 kb,2.66 kb,2.6 kb,2.48 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb八条带,而阴性克隆的腺病毒空载组有14 kb,11.8 kb,4.0 kb,2.47 kb,1.45 kb,0.6 kb六条带,证明重组pAdeno-EGFP-HIF1α腺病毒质粒构建成功;pAdeno-EGFP-HIF-1 α重组腺病毒成功包装纯化后经PCR鉴定,实验组和阳性对照组中均扩增到2.5 kb片段,证明目的病毒中成功整合了HIF-1 α基因;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×1010 PUF/ml.结论 成功构建了HIF-lα和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究其在脊髓损伤中的作用奠定了基础.