体外研究小鼠心肌细胞自噬过程中人抗原R对溶酶体酸化的作用

目的 探讨人抗原R在体外培养的小鼠心肌细胞自噬过程中对溶酶体酸化的作用.方法 取1～2d龄C57BL/6小鼠(雌雄不限)20只,分离心脏培养原代心肌细胞,进行以下实验.(1)采用随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为5组,即正常对照组和无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组.正常对照组用DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)54.0 h,无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组常规培养53.5、53.0、51.0、48.0 h后更换无糖无血清培养基分别处理0.5、1.0、3.0、6.0h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白5、腺苷三磷酸酶V1区E1亚基(ATP6V1E1)蛋白表达.(2)将细胞分为正常对照组和无糖无血清3.0h组,相应各组细胞处理同实验(1),激光扫描共聚焦显微镜下观测细胞溶酶体酸化水平.(3)取2个批次细胞,均同实验(1)分组处理,蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白及另一个批次细胞胞质、胞核蛋白中人抗原R蛋白表达.(4)将细胞分为正常对照组、单纯对照小干扰RNA (siRNA)组、单纯人抗原R-siRNA1(HuR-siRNA1)组、单纯HuR-siRNA2组、无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+ HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组.常规培养48 h后,单纯对照siRNA组及无糖无血清+对照siRNA组加入阴性对照siRNA、单纯HuR-siRNA1组及无糖无血清+HuR-siRNA1组加入HuR-siRNA1、单纯HuR-siRNA2组及无糖无血清+HuR-siRNA2组加入HuR-siRNA2转染6h,8组均继续常规培养48 h后,正常对照组及各单纯siRNA处理组更换DMEM/F12培养基、其余各组更换无糖无血清培养基培养3h,蛋白质印迹法检测细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达.(5)取2个批次细胞,均分为无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验(4),免疫荧光法观测一个批次细胞人抗原R分布及表达,激光扫描共聚焦显微镜下观测另一批次细胞溶酶体酸化水平.(6)取3个批次细胞,均分为无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+ HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组,相应各组细胞处理同实验(4),蛋白质印迹法检测一个批次细胞总蛋白中组织蛋白酶D、一个批次细胞胞质蛋白中人抗原R及另一个批次细胞总蛋白中ATP6V 1E1蛋白表达.(7)将细胞分为正常对照组、无糖无血清3.0h组、无糖无血清+对照siRNA组、无糖无血清+HuR-siRNA1组,相应各组细胞处理同实验(4),实时荧光定量反转录PCR法检测细胞ATP6V1 E1 mRNA表达.各实验样本数均为3.对数据进行独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正. 结果 (1)与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0h组细胞总蛋白中LC3Ⅱ、ATP6V1E1蛋白表达显著增加(t=12.16、4.05、4.82,11.64、3.29、8.37,P ＜0.05或P＜0.01),无糖无血清0.5、1.0、3.0、6.0h组细胞总蛋白中自噬相关蛋白5蛋白表达显著增加(t=6.88、10.56、5.76、9.91,P＜0.05或P＜0.01).(2)与正常对照组的1.03±0.08比较,无糖无血清3.0h组细胞溶酶体酸化水平(2.92±0.30)明显升高(t=6.01,P＜0.01).(3)5组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达组间总体比较,差异无统计学意义(F =1.09,P＞0.05).与正常对照组比较,无糖无血清1.0、3.0、6.0h组细胞胞质蛋白中人抗原R蛋白表达显著增加(t=43.05、11.07、5.39,P＜0.05或P＜0.01),无糖无血清3.0、6.0h组细胞胞核蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=11.18、12.71,P＜0.01).(4)与单纯对照siRNA组比较,单纯HuR-siRNA1组、单纯HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t =4.82、4.44,P＜0.05).与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组细胞总蛋白中人抗原R蛋白表达显著减少(t=4.39、6.27,P＜0.05).(5)与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+ HuR-siRNA1组细胞胞质中人抗原R分布减少、表达水平显著降低(t =10.13,P＜0.01).与无糖无血清+对照siRNA组的1.00 +0.06比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞溶酶体酸化水平(0.73±0.06)显著下降(t=3.28,P＜0.01).(6)与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+ HuR-siRNA1组、无糖无血清+HuR-siRNA2组细胞总蛋白中组织蛋白酶D、胞质蛋白中人抗原R、总蛋白中ATP6V1E1蛋白表达均显著减少(t=4.16、3.99,4.81、5.07,11.68、12.97,P＜0.05或P＜0.01).(7)与正常对照组比较,无糖无血清3.0h组细胞中ATP6V1 E1 mRNA表达显著增加(t=5.51,P＜0.05).与无糖无血清+对照siRNA组比较,无糖无血清+HuR-siRNA1组细胞中ATP6V1 E1 mRNA表达显著减少(t=5.97,P＜0.05). 结论 小鼠原代心肌细胞在体外无糖无血清处理后自噬激活、溶酶体酸化增强、胞质中人抗原R表达增加,人抗原R功能激活并参与维持小鼠心肌细胞自噬过程中的溶酶体酸化.