miR146a通过Smad4参与多柔比星的心肌细胞毒性作用

目的:探讨miR146a参与多柔比星心肌细胞毒性作用的可能机制.方法:用多柔比星处理大鼠心肌细胞,用CCK-8方法检测细胞活力,用荧光定量PCR检测miR146a的变化,用Western blot检测切割的Caspase 3的蛋白变化.使用常间回文重复序列丛集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的方法,设计针对miR146a的向导RNA,敲除miR146a的表达.用CCK-8方法和Western blot分别检测敲除细胞的活力和Caspase 3蛋白变化.用软件预测miR146a的靶基因,利用荧光素酶系统进行验证.用Western blot检测多柔比星处理后靶基因的变化,以及用Western blot检测敲除miR146a对靶基因变化的影响.结果:多柔比星处理导致大鼠心肌细胞活力降低,切割的Caspase 3水平升高,同时发现miR146a表达升高(3.6倍).使用CRISPR可有效敲除miR146a的表达,敲除效果显著高于microRNA decoy的效果(88.6％ vs 57.6％).敲除miR146a的细胞用多柔比星处理,miR146a增加不明显(1.08倍),并且敲除miR146a抑制了多柔比星导致的细胞活力降低和Caspase 3升高.经生物信息学及荧光素酶检测证实在大鼠心肌细胞内Smad family member 4(Smad4)是miR146a的靶基因,用多柔比星处理心肌细胞后,Smad4的表达降低.而敲除miR146a后,Smad4的表达升高,用多柔比星处理敲除miR146a的细胞,Smad4的表达变化不明显.结论:大鼠心肌细胞中,miR146a通过调节Smad4的表达参与了多柔比星对细胞的毒性作用.