靶向线粒体绿色荧光蛋白表达载体的构建及初步应用

目的:构建靶向线粒体绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体,观测其在蛋白质细胞内定位中的应用价值。方法:化学合成细胞色素C氧化酶8A亚单位信号肽编码序列,克隆该序列到载体pEGFP-N1多克隆区Nhe I和Hind III位点得到质粒pMito-EGFP,经测序鉴定后,用线粒体探针mitotracker染色已转染该载体的Hela细胞,荧光显微镜检测EGFP的细胞定位。以EPEC/EspF和EPEC/EspFL16E感染经pMito-EGFP转染的Hela细胞,免疫细胞化学法和荧光显微镜法观测野生型EspF和突变型EspFL16E的分布。结果:测序表明融合表达载体构建成功,荧光显微镜及图像分析表明该载体表达的EGFP和mito-tracker共同定位于细胞线粒体;用其作为探针发现:野生型EspF定位于细胞线粒体,而突变型EspFL16E定位于胞浆中。结论:pMito-EGFP可作为线粒体的分子探针对靶向线粒体的蛋白进行亚细胞定位。