四环素基因表达调控系统介导的HBV X基因体外表达细胞株的建立

目的建立稳定、高效的HBxAg体外表达细胞株,以便进一步研究HBV X基因和HBxAg的致癌作用及机理.方法构建带有完整四环素基因关闭(Tet-off)系统的HBV X基因重组表达质粒pBPSTR1-FlagX,用该重组质粒转染NIH 3T3细胞,筛选嘌呤霉素抗性细胞克隆,用抗-FlagM2单抗和兔抗-HBx作蛋白质免疫印迹分析,检测细胞内Flag-HBxAg表达和四环素调控其表达的情况.结果重组质粒pBPSTR1-FlagX转染NIH 3T3细胞后获得30个生长良好的嘌呤霉素抗性细胞克隆.其中12个细胞克隆有Flag-HBxAg的稳定表达,且有5个克隆的Flag-HBxAg表达受四环素调控.当四环素浓度逐渐增高时,细胞内Flag-HBxAg的表达逐渐减弱.四环素浓度达1μg/ml时,Flag-HBxAg表达被完全抑制.结论本研究成功构建了四环素调控系统介导的HBV X基因体外表达细胞株,该细胞株不仅能稳定高水平地表达HBxAg,而且具有定时"开""关"和定量调节HBxAg表达水平的特性,是HBV X基因功能研究的一个有用工具.