SYBR greenⅠRQ-PCR定量检测DNA方法的改良与建立

目的探讨用改良SYBRgreenⅠ实时定量PCR(RQPCR)技术消除引物二聚体(PDs)对定量分析的影响,建立准确的定量检测DNA含量的方法。方法以βactin为目的基因,通过对扩增产物和PDs熔解曲线的分析找出各自的解链温度(Tm),选择在高于PDsTm但低于目的片段Tm的温度时检测荧光信号,建立改良SYBRgreenⅠRQPCR方法。结果该法可消除PDs对SYBRgreenⅠRQPCR的影响。用此法构建所得标准曲线斜率为-3.178866,相关系数为-0.980535,PCR反应动力学范围达5个log值(102～106);精确性检测中,DNA含量实测值与预测值的差异无统计学意义(P>0.05);稳定性检测中,3种不同浓度标本的批内变异和批间变异分别为1%、3%、2%和2%、4%、4%。结论改良SYBRgreenⅠRQPCR可有效消除PDs对定量分析的影响,对目的基因DNA拷贝数进行PCR反应线性范围广、敏感性、精确性和稳定性好的定量检测。是一种简便实用的DNA定量检测的方法。