突变型人PRKAG2基因的克隆及其表达载体构建

目的构建含有定点突变的人PRKAG2基因表达载体。方法首先应用Trizol法抽提健康人全血mRNA,通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)克隆得到野生型人PRKAG2 cDNA;继而通过聚合酶链反应(PCR)定点突变的方法获得突变型人PRKAG2基因,命名为G100S,最后应用酶切连接的方法得到重组载体pEGFP-G100S。结果Trizol法提取人细胞mRNA,经RT-PCR合成cDNA第一条链,特异性引物PCR扩增得到PRKAG2基因片段,目的片段条带在1 761 bp左右。分段克隆得到的G100S片段分别为300 bp与1 500 bp左右。转化Top10感受态细菌,PCR筛选阳性菌落5个克隆有3个克隆可见1 800 bp左右的阳性片段,筛选得到pEGFP-G100S重组阳性克隆。测序证实重组载体pEGFP-G100S构建成功。结论构建的含定点突变人PRKAG2基因重组载体pEGFP-G100S为进一步研究基因PRKAG2 G100S突变的功能奠定了基础。