小鼠干细胞成骨和成软骨分化特异性微小RNA的初步研究

目的 通过对C3H10T1/2细胞进行成骨及成软骨分化,利用微小RNA (microRNA,miRNA)芯片技术筛选成骨分化和成软骨分化中差异miRNA,以期寻找调节C3H10T1/2细胞成骨及成软骨分化的特异性miRNA. 方法 取C3H10T1/2细胞系,分别行成骨和成软骨诱导分化,对诱导组和对照组进行鉴定.然后通过miRNA芯片技术筛选分化前后2倍变化幅度且平均标准化信号值＞2的差异miRNA,并行实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)验证. 结果 诱导7d成骨诱导组较对照组有明显ALP表达(P＜0.05);诱导7、14、21d,RT-qPCR检测成骨诱导组成骨标志物Runx2、丝氨酸蛋白酶7(serine protease 7,Sp7)、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN) mRNA相对表达量均显著高于诱导0d时(P＜ 0.05);诱导21d,Western blot检测成骨诱导组Runx2、Sp7、Ⅰ型胶原、OPN蛋白表达量明显高于对照组(P＜0.05).成软骨诱导5、10、15d,RT-qPCR检测成软骨诱导组软骨标志物SOX9、Ⅱ型胶原、蛋白多糖(Aggrecan)、透明质酸合成酶(Has2) mRNA相对表达量均显著高于诱导0d时(P＜0.05);诱导15d,Western blot检测成软骨诱导组SOX9、Ⅱ型胶原、Aggrecan、Has2蛋白表达量明显高于对照组(P＜0.05).通过miRNA芯片技术分别筛选出10个成骨和3个成软骨2倍变化幅度且平均标准化信号值＞2的差异miRNA.除miR-455-3p之外,其余差异miRNA验证结果与芯片结果比较有较好一致性. 结论 通过miRNA芯片技术对C3H10T1/2细胞系以及其诱导成骨和成软骨分化细胞进行检测对比,发现部分miRNA表达量在诱导后细胞中发生变化,为进一步挑选成骨和成软骨特异性miRNA进行功能验证和靶基因预测奠定了基础.