shRNA干扰己糖激酶Ⅱ基因表达对人淋巴瘤细胞恶性生物学行为的影响

目的:观察shRNA干扰己糖激酶(hexokinase,HK)Ⅱ基因表达对人淋巴瘤Raji和SU-DHL-4细胞代谢、增殖、凋亡及耐药的影响,初步评价HK Ⅱ基因靶向治疗在淋巴瘤中的潜在应用前景.方法:构建慢病毒介导的shRNA靶向干扰HK Ⅱ基因表达的淋巴瘤细胞株Raji和SU-DHL-4(HK Ⅱ shRNA转染组),同时设置阴性shRNA转染对照组.采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别检测细胞中HK ⅡmRNA和蛋白的表达水平.锥虫蓝拒染法检测细胞存活数并绘制生长曲线;CCK-8法检测多柔比星(doxorubicin,DOX)对淋巴瘤细胞的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50).FCM法分析细胞周期分布及细胞凋亡.蛋白质印迹法检测细胞中凋亡相关蛋白caspase-3及其剪切体、Bcl-2和Bcl-6的表达;分别应用乳酸和葡萄糖检测试剂盒检测细胞培养上清液中乳酸和葡萄糖的浓度.结果:与空质粒转染对照组细胞相比,HK Ⅱ shRNA转染组细胞中HK ⅡmRNA及蛋白的表达水平均明显降低(P值均＜0.05).shRNA干扰HK Ⅱ基因表达能抑制2种淋巴瘤细胞的增殖活性(P值均＜ 0.01),并使细胞周期阻滞在G0/G1期(P值均＜0.05),同时促进细胞凋亡(P值均＜0.01).与对照组细胞相比,HK Ⅱ基因沉默可降低DOX对2种淋巴瘤细胞的IC50值(P值均＜0.05),抑制细胞中葡萄糖消耗(P值均＜ 0.05),减少乳酸生成(P值均＜ 0.01).与对照组细胞相比,HK Ⅱ shRNA转染后2种淋巴瘤细胞中Bcl-2蛋白的表达水平明显降低(P值均＜0.05),而caspase-3剪切体表达水平明显升高(P值均＜ 0.05);加入DOX作用后,2种淋巴瘤细胞的Bcl-2表达水平无明显差异(P值均＞0.05),但HK Ⅱ shRNA转染组细胞中caspase-3前体蛋白表达水平明显降低(P值均＜0.01),而caspase-3剪切体表达水平升高更加明显(P值均＜0.05).结论:shRNA干扰HK Ⅱ基因表达可抑制淋巴瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,纠正细胞糖酵解代谢表型,提高细胞对化疗药物DOX的敏感性.提示HK Ⅱ基因可能是治疗复发或耐药侵袭性淋巴瘤的潜在靶点.