Anxa5真核表达质粒构建及其对小鼠肝癌Hca-P细胞增殖影响观察

目的:构建pcDNA3.1-V5/HisB-Anxa5真核表达质粒,获得膜联蛋白A5 (Annexin A5,Anxa5)表达稳定上调的小鼠肝癌Hca-P细胞株,探究Anxa5上调对Hca-P增殖的影响.方法:利用RT-PCR扩增小鼠全长Anxa5编码序列,将其克隆到pcDNA3.1-V5/HisB载体中,并将构建的pcDNA3.1-V5/HisB-Anxa5表达质粒转入Hca-P细胞.采用G418筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,观察细胞形态变化.蛋白质印迹法分析Anxa5表达情况,CCK-8法检测相应Hca-P细胞的增殖能力.结果:酶切及测序结果显示,pMD(R)18-T-Anxa5克隆质粒和pcDNA3.1-V5/HisB-Anxa5表达质粒构建成功；获得了Anxa5表达稳定上调的单克隆细胞株；与正常Hca-P比较,Anxa5蛋白在pcDNA3.1-V5/HisB-Anxa5-Hca-P单克隆细胞中上调了59.5％,P=0.016；pcDNA3.1-V5/HisB-Anxa5-Hca-P增殖显著加快,P=0.002.结论:成功构建了Anxa5真核表达质粒并获得Anxa5表达稳定上调的小鼠肝癌Hca-P细胞株,Anxa5上调对Hca-P细胞的增殖具有促进作用,为后续研究提供实验基础.