嗜麦芽寡养单胞菌D2株smp基因缺失株的构建及鉴定

为深入研究smp基因的功能,需构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株smp基因缺失株.首先,PCR扩增D2株smp基因上游、下游片段作为上下游同源臂,同时扩增获得氯霉素抗性(cat)基因,采用SOE-PCR方法将各片段连接,然后双酶切后克隆入自杀质粒pEX18Tc,构建获得重组自杀质粒pEX18Tc-△smp/cat,并转化入大肠埃希菌SM10λpir.通过接合将重组自杀质粒转入嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株,经同源重组以cat基因替换野生株的smp基因,链霉素和氯霉素双抗培养基筛选接合子,15％蔗糖选择培养基筛选smp基因缺失株.PCR、酶切和测序验证重组自杀质粒pEX18Tc-△smp/cat构建正确,缺失株的分泌蛋白经12％ SDS-PAGE证实嗜麦芽寡养单胞菌D2株smp基因缺失株失去表达SMP蛋白的能力.结果显示成功获得smp基因缺失的嗜麦芽寡养单胞菌D2株,为进一步研究其功能和胞外分泌途径奠定基础.