罗氏沼虾野田村病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

[目的]建立一种检测罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)的实时荧光定量RT-PCR,为防控罗氏沼虾白尾病(White tail disease,WTD)提供技术支持.[方法]将MrNV衣壳蛋白基因片段(No.HQ287005)克隆到pGM-T载体,选取阳性重组质粒用Sa l酶切获得线性化转录模板DNA,经体外转录获得标准品RNA;在MrNV基因序列的保守区域设计1对扩增片段为119bp的特异性引物,以标准品RNA为模板进行引物浓度筛选及标准曲线制定,并对建立的检测方法进行标准曲线和融解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验.[结果]建立的一步法实时荧光定量RT-PCR定量范围宽,检测模板范围在1×101～1×108拷贝/此时,其标准曲线呈良好的线性关系;融解曲线表现为单一波峰,Tm为81.17～81.25℃;扩增曲线呈明显的S形,以C值35.00为界限,灵敏度约为10个病毒粒子,是常规RT-PCR的1000倍.该方法仅对MrNV具有良好的特异性,其组内和组间试验的C值变异系数分别为0.15％～0.83％和0.56％～0.95％;对83份罗氏沼虾临床样品进行检测,其结果与套式RT-PCR的检测结果一致.[结论]针对MrNV检测建立的一步法实时荧光定量RT-PCR具有快速、便捷、灵敏、准确等优点,且对样品的检测范围宽,适用于MrNV隐性感染和发病诊断.