基于细菌展示技术的高通量抗原表位筛选方法的建立

目的:本研究旨在利用细菌表面展示技术结合流式细胞术建立一种快速直观的抗原表位的新方法.方法:本研究以传染性法氏囊病毒结构蛋白VP2作为目标蛋白,对该方法的可行性进行检测.将VP2基因分为连续不重叠的5个基因片段(V1～V5).将各段基因分别克隆至细菌展示载体pAPEx中,转化大肠杆菌DH5 α,利用IPTG诱导使蛋白片段锚定表达于大肠杆菌细胞间质侧的内膜上,利用溶菌酶破除细菌外膜(原生质球制备),使蛋白片段暴露于原生质球表面.将该原生质球先后与传染性法氏囊病毒多克隆抗体和FITC标记的兔抗鸡抗体进行孵育,利用流式细胞仪(Flow cytometer,FC)检测原生质球的荧光信号强度.结果:FC结果显示,除V2片段外其余片段均有很强的荧光信号,其荧光强度为V3最强,V1、V4、V5其次.该结果说明V1、V3、V4、V5段存在抗原表位,V2段中无表位.为验证FC结果,本研究利用传统方法对各基因片段进行表达、纯化及Western blot鉴定,结果显示V3与多抗的结合能力最强,V2段无阳性反应,与FC结果相符.此外,本研究利用抗原表位分析软件对各蛋白片段潜在抗原表位进行预测,其结果与FC结果相一致.结论:本研究利用FC对抗原表位筛选过程进行实时监测,通过荧光信号强弱即可判断抗原表位是否存在及强弱,与传统抗原表位筛选方法相比,节省了时间提高了效率.利用该方法可以快速地筛选出优势表位,对于流行病病原的基础研究及疫苗的研制具有重要意义.